胶体金免疫层析法快速诊断血吸虫病的研究*

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胶体金免疫技术是一项继免疫荧光、免疫酶、放射免疫三大标记技术之后发展起来的新标记技术,已被广泛用于医学和生物学等诸多领域,如人类免疫缺陷病毒、甲胎蛋白、幽门螺杆菌、布鲁氏菌病及华支睾吸虫等检测〔1-4〕。目前血吸虫病免疫学诊断方法主要采用间接血凝试验(IHA)和酶联免疫吸附试验(ELISA),2种方法均存在操作步骤复杂,检测速度慢等缺点。为提高血吸虫病检测的水平和时效,我们对胶体金免疫技术快速诊断血吸虫病作进一步研究,现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 胶体金免疫层析法(GICA)诊断试剂 由浙江省医学科学院研制。将喷有质控线、检测线的硝酸纤维素膜切成0.4cm×6cm长条,在其上端贴上吸水垫,下端贴上金标垫及样品吸收垫;置于塑料卡中,加干燥剂密封后室温保存。

1.1.2 斑点金免疫渗滤法(DIGFA)和间接血凝试(IHA)诊断试剂 由浙江省医学科学院研制。

1.1.3 病人血清 采用浙江省输入性血吸虫病粪检阳性病人血清和安徽省血吸虫病粪检阳性病人血清。

1.1.4 健康人血清 采用非血吸虫病流行区山西省大同市天镇县陆家湾镇健康人血清。

1.1.5 交叉血清 采用本实验室保留的肺血吸虫病人、华支睾吸虫病人和乙肝病人血清。

1.2 方法

1.2.1 GICA操作 在检测板加样孔内加入待检血清10μ L,待渗入后,加入生理盐水 100μ L,5min后观察结果。检测线和质控线均出现红色为阳性;检测线无色,质控线出现红色为阴性。

1.2.2 DIGFA和 IHA操作 参照浙施晓华等报道〔5-6〕和血吸虫病防治手册〔7〕。

1.2.3 敏感性测试 检测血吸虫病粪检阳性病人血清,观察阳性符合率。

1.2.4 特异性测试 检测血吸虫病非流行区健康人血清,观察阴性符合率。

1.2.5 交叉反应测试 检测肺血吸虫病人、华支睾吸虫病人和乙肝病人血清,观察交叉反应。

1.2.6 稳定性和重现性试验 将保存于室温下的GICA试剂,每隔3个月用同批血清测定1次,连续测定5次(1年)。每次测定病人和健康人血清。观察试剂的稳定性和重现性试验。

1.2.7 GICA与DIGFA及IHA比较 检测病人和健康人血清,比较3种试剂的敏感性和特异性。

1.2.8 试验原则与统计学方法 样本检测按照单盲试验原则,实验结果由2人共同判读。GICA、DIGFA及IHA检测结果数据应用SPSS软件进行统计学分析。

2 结 果

2.1 GICA敏感性及特异性的测试 GICA检测病人血清106份,阳性98份,阳性率92.5%;检测健康人血清120份,阳性5份,阳性率4.2%;其敏感性和特异性分别达到92.5%和95.8%,youden指数为0.883。

2.2 GICA交叉反应测试 GICA检测肺吸虫病人血清10份,阳性3份;检测华支睾吸虫病人血清12份,阳性 3份;检测乙肝病人血清 35份均为阴性。

2.3 重现性试验和稳定性试验 将保存于室温下的GICA试剂,每隔3个月,测试1次,每次检测病人血清30份和健康人血清30份,先后重复测试5次。结果病人血清29份阳性,1份阴性;健康人血清,均阴性。重复检测5次结果一致。

2.4 GICA、DIGFA及IHA 3种方法检测血吸虫病敏感性、特异性比较见表1。

表1 GICA、DIGFA及IHA检测血吸虫病敏感性、特异性比较Table 1 Cooperation of sensitivity and specificity on schistosomiasis with GICA,DIGFA and IHA

经χ2检验3种方法检测血吸虫病敏感性、特异性结果之间无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨 论

目前血吸虫病免疫学诊断主要采用间接血凝试验(IHA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,2种方法存在操作步骤复杂,检测速度慢等缺点。金标记技术是近年发展起来的新标记技术,国内已有学者对金标记技术用于血吸虫病诊断进行研究,已有应用斑点金免疫渗滤法(DIGFA)研发了血吸虫病诊断试剂〔5-6〕;还有对快速胶体金免疫层析法的建立及其对血吸虫病诊断效果研究〔8〕,均取得了较理想的结果。

本研究对胶体金免疫层析快速诊断血吸虫病试剂的敏感性、特异性和交叉反应进行了研究。结果显示GICA试剂敏感性和特异性分别达到92.5%和95.8%,Youden指数为0.883;符合试剂应用要求。GICA试剂未发现与乙肝病人有交叉反应;但发现与肺吸虫和华支睾吸虫病人存在较高交叉反应,可能这3种吸虫之间存在某些共同抗原,有待于进一步研究和改进。

免疫诊断试剂除了要求有较高的敏感性和特异性外,还必须具有良好的稳定性和重现性,稳定性和重现性是诊断试剂质量的又一重要指标,也是试剂保存条件和有效期限的惟一依据。对保存于室温下的GICA试剂,1年内重复测试5次,结果不变。表明GICA试剂具有很好的重现性和稳定性,室温保存有效期限至少1年。

GICA与DIGF和IHA 3种方法检测血吸虫病人和健康人血清结果比较,3种方法之间无统计学意义(P＞0.05)。IHA是一种传统血吸虫病免疫诊断方法,具有较高的敏感性和特异性,但其操作步骤比较复杂,使用器械多,血清用量25μ L,检测时间性长(1h),需花费较多的人力和物力;DIGFA具有敏感性强,特异性高优点,且操作简便,血清用量25μ L,检测速度快(2min),但试剂为液体,保存期限短;胶体金免疫层析法(GICA)同样具有试剂敏感、特异外,血清用量更少(10μ L),操作更为简便,试剂为固态,携带方便,保存期长等优点,适合于血吸虫病流行病学调查及现场应用,为血吸虫病的防治提供一种新的手段。

〔1〕曹锡坤,陶义训,韩松,等.滴金免疫测定法在检测血清甲胎蛋白中的应用〔J〕.上海免疫学杂志,1991,11(3)：154-156.

〔2〕沈丽英,干小仙,丁建祖,等.检测幽门螺杆菌抗体的金标免疫渗滤法的建立与应用〔J〕.浙江实用医学,1997,2(4)：14-15.

〔3〕王鹏,郭英,石丽媛,等.鼠疫FI单克隆抗体的胶体金标记及斑点渗滤法检测FI抗原方法的建立〔J〕.中国地方学病杂志,2005,24(5)：479-481.

〔4〕朱明东,洪林娣,等.胶体金免疫层析法快速诊断布鲁氏菌病的研究〔J〕.国际流行病学传染病学杂志,2008,35(3)：158-160.

〔5〕施晓华,汤益,将健敏,等.滴金免疫测定法(DIGFA)检测血吸虫抗体的研究〔J〕.中国血吸虫病防治杂志,1999,11(3)：132-133.

〔6〕沈丽英,干小仙,丁建祖,等.金标免疫渗滤法快速检测血吸虫循环抗原的研究〔J〕.中国人兽共患病杂志,2000,16(1)：12-16.

〔7〕中华人民共和国卫生部疾病控制司.血吸虫病防治手册〔M〕.3版.上海科学技术出版社,2000：88-90.

〔8〕曾小军,陈红根,袁建华,等.快速胶体金免疫层析法的建立及其对血吸虫病诊断效果〔J〕.中国血吸虫病防治杂志,2005,17(1)：24-27.