结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3的表达、纯化和鉴定

杨 巍,师长宏,赵佐庆,赵 勇,江 鹰

2.第四军医大学唐都医院实验外科,

卡介苗(BCG)是目前唯一用于结核病(TB)预防的疫苗,但其保护效果不稳定。近年来,由于结核分枝杆菌(MTB)耐药株的流行与HIV的合并感染以及人口流动的增加等因素,进一步加剧MTB对人类健康的威胁,因此迫切需要研制新型有效的TB疫苗。Ag85B是BCG和MTB及其它分枝杆菌最主要的分泌蛋白〔1〕,也是BCG在体内发挥生物学作用的主要成分,能够诱导机体强烈的Th1免疫反应〔2〕;Hsp16.3是MTB在休眠期间表达量增加最多的蛋白,它与M TB的休眠及潜伏感染密切相关〔3〕。进一步实验表明多个保护性抗原联合免疫可提高机体免疫应答水平,诱导与BCG相当的保护力,提示多价疫苗可能是提高TB疫苗有效性的一种新策略〔4〕。鉴于此,本研究对MTB不同时期表达的两种重要保护性抗原Ag85B和Hsp16.3进行融合表达,以便进一步研究其在结核病基因工程疫苗中的应用。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒 大肠杆菌E.coliDH5α,由本中心保存;克隆载体pMD18-T质粒购自大连T akara公司;表达载体pProEX H Ta质粒购自Invitrogen公司。

1.2 试剂 TaqDNA聚合酶,T4-DNA连接酶,限制性内切酶EcoRI、ClaI、HindIII及 DNA 标记物DL 2000均购自大连T akara公司;IPTG购自Sigma公司;质粒小量抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自百泰克公司;Ag85B多克隆抗体和H sp16.3单克隆抗体购自Abcam公司;HRP标记的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG和羊抗人IgG购自北京鼎国生物公司;纯化Ag85B-Hsp16.3的融合蛋白由本实验室制备;含有Ni+螯合剂的Ni-NTA His纯化试剂盒购自Invintrogen公司;其余一般化学试剂均为国产分析纯。TB阳性病人血清来自第四军医大学西京医院呼吸内科。

1.3 目的基因的扩增 重组质粒pProEX HTa-Ag85B-ESAT6 由本中心保存〔5〕,其中 Ag85B 、ESAT6的酶切位点分别是EcoRI和ClaI、ClaI和HindIII,鉴定正确;hsp16.3基因以本中心保存的pProEX HT b-Hsp16.3 质 粒为 模板〔6〕,根据 Gen-Bank中公布的结核分枝杆菌hsp16.3基因序列设计引物。为保证这两种蛋白融合表达时具有各自的空间构象和正确折叠,在hsp16.3基因上游引物引入了48bp的疏水柔性链接头(linker)。引物如下：

P1：5'-GAATCGATGGTGGCTCAGGTGGCTCCGGTGGAGGCGGAAGCGGCGGTGGAG GATCAATGGCCACCACCCT TC-3'含ClaⅠ酶切位点(下划横线);

P2：5'-TCAAAGCTT TCAGTTGGTGGACCGGATC-3'含HindIII酶切位点(下划横线)。PCR 反应体系为 ：10 ×buffer 5μ L,dN TPs 4μ L(2.5 mmol/L),DNA 模板1μ L,两对P1、P2引物各1μ L 及Taq酶1μ L,加水至50μ L。PCR 反应条件：94℃变性 3 min,94℃45s,60℃45s,72℃50s,共 30个循环,最后再于72℃延伸5 min,回收PCR产物。

1.4 目的基因的克隆与测序 T4连接酶将PCR产物与 pMD18-T克隆载体连接,转化E.coliDH5α。随机挑取3个菌落,接种于含氨苄青霉素的LB培养液中,37℃震荡培养12 h,提取质粒DNA,并用ClaI和HindIII双酶切进行鉴定,观察有无目的片段。将筛选出的阳性克隆进行测序(由北京奥科生物技术有限公司完成测序)。将测序正确已含有linker和hsp16.3基因的pMD18-T克隆载体记作pMD18-T-L-Hsp16.3。

1.5 含目的基因表达载体的构建及目的基因的诱导表达 提取测序正确的重组克隆质粒pMD18-TL-Hsp16.3,经ClaI和HindIII双酶切后,回收目的基因条带命名为L-Hsp16.3。将本中心保存的测序正确的 pProEX HT a-Ag85B-ESAT6质粒经ClaI和HindIII双酶切,回收大片段命名为 pProEX HTa-Ag85B,连接同样双酶切的L-Hsp16.3片段,转化E.coliDH5α感受态细胞,随机挑选3个菌落,接种于含氨苄青霉素的LB培养液中,37℃过夜培养活化,提质粒用EcoRI和HindIII进行双酶切鉴定,阳性克隆命名为 pProEX HTa-Ag85B-Hsp 16.3。将此阳性菌再活化后以1∶100的比例转接到含氨苄青霉素的LB培养液中,37℃振荡培养2～3h,1mmol/L IPTG诱导4 h,离心回收菌体沉淀,分别加入100μ L的去离子水与100μ L还原性2×电泳上样缓冲液,煮沸10min,离心后取10μ L上清进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,观察目的蛋白的表达。

1.6 融合蛋白 Ag85B-Hsp16.3的 Western-blot测定 将上述表达产物进行12%SDS-PAGE后,100V恒压电转1h,用丽春红染色,观察蛋白电转是否成功,然后用蒸馏水洗至无色,l0g/L牛血清白蛋白封闭2h,然后分别与兔抗的Ag85B多克隆抗体和鼠抗的Hsp16.3单克隆抗体以及活动期结核病人血清结合过夜,TBST摇床震荡洗涤3次,每次5～10min,分别与加HRP标记的羊抗兔、羊抗鼠和羊抗人 IgG结合 1h,TBST摇床震荡洗涤3次,TBS摇床震荡洗涤3次,用OPD(邻苯二胺)显色液显色并观察结果。

1.7 融合蛋白Ag85B-Hsp16.3的纯化 采用含有Ni+螯合剂的Ni-NTA His纯化试剂盒纯化目的蛋白,将100mL诱导后的菌液离心,制备上柱样品,按照说明书中的方法进行亲和层析纯化,收集洗脱液,进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

2 结 果

2.1 目的基因Hsp16.3的扩增、克隆及酶切鉴定

琼脂糖凝胶电泳显示Hsp16.3基因的PCR产物大小在 483bp左右(Hsp16.3基因为 435bp,含48bp的linker),与Hsp16.3的基因预期大小相符见图1。

重组克隆质粒双酶切后经琼脂糖电泳检测到大小为1 338 bp左右的片段(Ag85B基因为855bp,Hsp16.3基因为 435bp,含 48bp的 linker),证明pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3构建成功见图 1。测序结果与GenBank数据库所收录的 Ag85BHsp16.3基因一致。

图1 重组质粒pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3的酶切鉴定1：DNA标记物 DL2000;2：重组质粒 pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3以EcoRⅠ 和 HindⅢ 双酶切;3：重组质粒 pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3以ClaⅠ和HindⅢ 双酶切;4：重组质粒 pProEX HTa-Ag85BHsp16.3以EcoRⅠ和ClaⅠ双酶切Fig.1 Recombinant plasmid pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3 by endonuclease digestion1：DNA marker DL2000;2：Recombinant plasmid pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3 by EcoRⅠand HindⅢ digestion;3：Recombinant plasmid pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3 by ClaⅠ and HindⅢ digestion;4：Recombinantplasmid pProEX HTa-Ag85B-Hsp 16.3 by EcoRⅠ and ClaⅠ digestion

2.2 Ag85B-Hsp16.3基因的诱导表达及纯化结果

重组菌诱导前后表达产物的SDS-PAGE显示,诱导的重组菌在约49 kDa处有一蛋白条带,同预计的大小相吻合,而未诱导菌无此条带。亲和层析法纯化得到的蛋白浓度为 0.7546mg/mL,经 SDSPAGE检测,可见同样大小的蛋白条带见图2。

2.3 表达产物与单抗的Western-blot鉴定 结果显示,无论是使用兔抗 Ag85B的多抗还是鼠抗Hsp16.3的单克隆抗体在相对分子量约为49 kDa处均有一条表达带见图3,表明Ag85B-Hsp16.3表达产物包含了兔抗Ag85B抗体和鼠抗Hsp16.3抗体的结合表位。

2.4 表达产物与活动期结核病人血清的Westernblot鉴定 结果显示,在相对分子量约为49 kDa处有一条表达带见图3,说明TB病人血清与Ag85BHsp16.3表达产物具有较好的反应性。

2.5 表达产物的可溶性检测 在重组表达菌液中加入胍裂解液,用超声波细胞粉碎机进行超声裂解后,离心,分别取上清和沉淀进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS2PAGE)分析,结果发现表达的融合蛋白主要以不可溶状态(包涵体)存在,可获得单一的纯化条带。

3 讨 论

近年来,国内外学者围绕新型Tb疫苗方面开展了一系列研究,其中包括亚单位疫苗和DNA疫苗,但这些研究大多是针对M TB单个免疫保护性抗原进行的,其免疫保护效果并不十分理想〔7〕。研究表明包含多个免疫保护性抗原的多价疫苗可能是提高其有效性的一种新策略〔4〕。鉴于此,本研究对MTB两种重要免疫保护性抗原Ag85B和Hsp16.3进行融合表达,以期诱导广泛而全面的免疫应答。

Ag85复合物(Ag85A、Ag85B和Ag85C)是牛分枝杆菌、BCG及MTB培养滤液中的主要分泌性蛋白,该复合物属于分枝菌酸转移酶,在MTB细胞壁合成的晚期起关键作用〔8〕。其中Ag85B诱导的细胞免疫反应最强,是抗结核免疫中的重要保护性抗原,其抵抗结核分枝杆菌再感染的能力优于BCG〔9〕。活动期结核患者血清中的Ag85B水平比其他分枝杆菌疾病患者和健康对照者高50～150倍〔10〕。Ag85B还可诱导PPD阳性健康人群外周血单个核细胞分泌高水平的IFN-γ,而活动期肺结核患者的外周血单个核细胞分泌IFN-γ的水平极低,也进一步表明Ag85B是机体重要的保护性靶抗原〔11〕。

Hsp16.3最初被认为是免疫显性蛋白,后被确定是MTB重要的膜蛋白,位于结核休眠菌增厚的膜上,其高度表达与休眠菌的形成和生存息息相关。基因敲除实验〔12〕证明 Hsp16.3是MTB稳定存在不可缺少的蛋白,结果显示如果没有该蛋白的表达,MTB无论在骨髓分离的巨噬细胞还是在T HP-1细胞系中都将受损而难以生存,更不可能长期休眠。Aparna Khera等〔13〕用表达 Hsp16.3、ESAT-6 和超氧化物歧化酶A的DNA疫苗免疫BALB/c小鼠和豚鼠后,用H37Rv进行攻击,与空质粒相比,诱发了强烈的免疫应答反应和免疫保护力。虽然Hsp16.3诱导的免疫应答及产生的保护力低于超氧化物歧化酶 A,但是高于 ESAT-6。可见,Hsp16.3有望成为新型结核疫苗的靶抗原,尤其是针对潜伏感染的新型TB疫苗。

由于Ag85B是MTB活动期分泌的重要蛋白,而Hsp16.3在休眠期高度表达,二者融合产物应该是对活动期结核和休眠期结核都具有较好的保护效力。本研究在Ag85B和Hsp16.3两个基因之间,引入了一段编码l6个氨基酸的疏水肽段,这段柔性肽的分子极性小,且富含甘氨酸和丝氨酸,易于弯曲,具有一定的弹性,能保证两种蛋白正确地折叠,从而确保两种蛋白具有各自独立的功能。实验中纯化的融合蛋白用兔抗Ag85B多抗和鼠抗Hsp16.3单抗进行免疫鉴定,结果均呈现清晰的阳性反应条带,证实纯化的蛋白为预期的Ag85B-Hsp16.3融合蛋白。纯化的融合蛋白与活动期结核病人血清具有较好的反应性,为进一步研究该融合蛋白的功能奠定了基础。

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