仔猪心肌原代细胞培养及其对口蹄疫病毒敏感性研究*

FMD是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性高度传染性疫病,被国际兽疫局列为A类动物传染病之首。在自然状态下FMDV可经消化道入侵感染,但呼吸道是最主要的 感染途径,数个感染性病毒颗粒即可引起易感动物发病。动物、人员及运输工具等均可机械性的散播病毒〔1〕。幼畜感染本病(以仔猪较多见)往往伴有心肌炎,心肌外呈现黄色条纹斑,心外膜有不同水平的出血点,呈现典型的“虎斑心”症状〔2〕,死亡率极高。文献对口蹄疫致幼畜心肌炎,早有描述,但其致病机理未见报道。

口蹄疫病毒对牛舌上皮、犊牛肾、犊牛甲状腺、仔猪肾、豚鼠肾、仓鼠肾、仔兔肾原代细胞和仔猪肾、叙利亚仓鼠肾传代细胞系(BHK21)都较敏感可以产生典型的致细胞病变(CPE)〔1〕。虽然口蹄疫病毒可以致仔猪等幼畜的心肌炎,但口蹄疫病毒是否感染心肌细胞还未见报道。

本试验参考 Simpson〔3〕等人大鼠心肌原代细胞培养方法和国内文献〔4-7〕,建立仔猪心肌原代细胞培养方法。然后用O型口蹄疫病毒接种心肌原代细胞来研究其对口蹄疫病毒的敏感性。为进一步研究口蹄疫诱发幼畜心肌炎的致病机理提供细胞模型和试验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康无FMDV感染的1 d长白仔猪购自兰州种猪场。

1.2 细胞株和病毒 BHK21细胞株,口蹄疫O型乳鼠适应毒MF6(o/China/99)为本实验室保存。

1.3 主要试剂及仪器设备 CMM 6201心肌专用培养基、DMEM(高糖)、胰蛋白酶和II型胶原酶购自Gibco公司;胎盘蓝;5-溴脱氧核苷(5-Bromodeoxyuridine;Brdu)购自Sigma公司,其余试剂均为国产分析纯。CO2培养箱购自德国Heraeus公司;倒置光学显微镜购自德国Laica公司。

1.4 仔猪心肌原代细胞的培养 将出生后1 d仔猪,用0.1%的新洁尔灭全身消毒后,迅速前腔静脉放血处死,解剖仔猪,无菌条件下剪取心室组织,用pH7.2的冰PBS液清洗干净后剔除纤维结缔组织,将组织反复剪成1～3 mm的小块。加入3～4mL 1∶1混合的2 g/L的胰蛋白酶和1 g/L的胶原酶,置37℃水浴中消化10 min后,自然沉淀,用吸管吸取(弃去)上清液(主要为红细胞、细胞碎屑及死细胞)。再加入3～4 mL的2 g/L胰蛋白酶和1 g/L胶原酶,置37℃水浴中消化15 min后,再混悬10 s,自然沉降。将上清液移入另一支无菌离心管中,并加入2 mL含有15%(10%～20%)小牛血清的培养液(或冷PBS液)以终止消化。如此反复消化3～8次,至组织块完全消化为止。将各次消化所制成的细胞悬液集中混匀。用200目的不锈钢过滤筛过滤后收集到离心管,2 000 r/min离心10 min后,用10%胎牛血清的CMM培养液重悬细胞,用计数板计数细胞,以5×105/mL的浓度每瓶(75 mL细胞瓶)加入 10 mL,放入37 ℃、5%CO2培养箱培养。

1.5 心肌细胞形态观察 常规倒置显微镜观察细胞形态变化、用相差显微镜观察心肌细胞搏动情况。

1.6 细胞成活率的测定 选用胎盘蓝染色法进行细胞存活率测定,死亡细胞被染成淡蓝色,活细胞拒染呈阴性反应。取细胞悬液,按9∶1加入0.4%台盼篮溶液混匀,在倒置显微镜下,任选10个视野,每次计数100个心肌细胞,计算细胞存活率。

1.7 O型口蹄疫乳鼠毒对仔猪细胞敏感性 口蹄疫O型乳鼠毒MF6(O/China/99)接种铺满单层的仔猪原代心肌细胞,设对照一瓶。每瓶(75mL细胞瓶)接种1mL。37℃、5%CO2孵箱中培养感作1 h,加DMEM 维持液9 mL。然后放37℃、5%CO2孵箱中培养观察。

1.8 心肌原代细胞毒毒价测定 用本室研制的间接红细胞凝集试验试剂盒和夹心ELISA试剂盒检测细胞毒型别。同时将原代细胞病毒液和BHK21细胞病毒液用DMEM细胞培养液按10倍系列稀释至 10-7,取 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-76个稀释度,用 96孔板,微量法测定细胞毒价,用Reed-Muench法计算 TCID50。

2 结 果

2.1 长白仔猪心脏细胞原代细胞的分离培养及纯化结果 用倒置显微镜观察原代心肌细胞,在未贴壁时呈圆形,贴壁后生长逐渐呈三角形(较多)、梭形、多角形,多形性、胞核1～2个、具有1～2清晰的核仁,细胞形态完整,生长迅速,部分单个细胞自行蠕动,当生长成片后可见呈岛屿状搏动,见图1、2。

2.2 细胞成活率测定 计数10个视野内共1 000个心肌细胞,44个细胞染色阳性,成活率为95.6%。

2.3 口蹄疫O型乳鼠毒对仔猪心肌原代细胞敏感性试验 用长白仔猪原代心肌细胞接口蹄疫O型乳鼠毒MF6(O/China/99),并进行传代 。从第二代起可以观察到明显的细胞病变(CPE)且随着传代次数的增加病变时间和收毒时间缩短。传至第6代收毒时间在20 h左右,14 h出现典型的致细胞病变(CPE),见图3～4。由此可见,本试验所培养的仔猪心肌原代细胞可以作为研究口蹄疫致仔猪心肌炎的细胞模型。

2.4 原代细胞毒型别和TCID50结果 用间接红细胞凝集试验和夹心ELISA试验对上述传代细胞毒进行口蹄疫型别测定,所有病变良好的细胞毒均与所接种的病毒在口蹄疫病毒型上一致。第五、第六代长白仔猪原代细胞毒毒价(lgTCLD50/ml)分别为3.75、4.33;第五、第六代BHK21细胞毒毒价(lgTCLD50/ml)分别为 4.00、4.83。

结果显示原代细胞毒的病毒毒价略低于平行传代的BHK21细胞毒。说明长白猪原代心肌细胞对口蹄疫的敏感性和BHK21细胞无差异。

3 讨 论

1955年,Cavanough对鸡胚心肌细胞进行分离和保存;1960年,Harary和Farley首次培养出Wistar乳鼠的心肌细胞,并维持其自发性节律搏动40d;1977年,Jacobson首次成功培养出成熟心肌细胞;1982年,Piper等又建立了另一种成熟心肌细胞培养模型〔8-9〕。但有关仔猪心肌原代细胞培养的研究国内外报道很少,而用仔猪心肌细胞进行口蹄疫病毒敏感性的研究更是未见报道。

体外培养的心肌细胞能够保持其在体内原有的许多结构和功能,同时排除了神经、体液等因素的干扰,因此体外培养在心肌细胞的生长、发育、生理、代谢、病理等研究中具有重要意义。同时,体外培养的心肌原代细胞较为纯净,进行病毒感染试验所得到的试验数据较为真实,避免了机体因感染其他病原而得到其他不一致的结果。同时用体外细胞模型试验,可以使试验过程容易重复。

通常认为,成熟的心肌细胞是终末分化型细胞,不具备有丝分裂能力。成年动物心肌细胞中约有15%～20%较年轻的心肌细胞,保留着增殖的能力。但心肌细胞增殖潜能的大小尚未知晓,缺乏形态学和生物学资料。由于各实验室所需要解决的问题、实验材料的取舍、实验室具体条件不同等,所采用的细胞培养方法也不尽相同。首先,笔者在选择试验动物时,在种猪场选择了出生1日龄的长白仔猪。经试验证明,出生后1日龄仔猪心肌原代细胞具有较高的细胞活力。其次,消化酶的浓度和消化时间是实验成功的关键。不同的实验室采用胰酶的浓度从0.05%～0.25%不等,胰蛋白酶浓度过高时,心肌组织中细胞及间质均受到影响,极易把组织消化成为透明粘稠状液体,使肌原纤维出现萎缩,细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力;胰蛋白酶浓度过低时,心肌组织消化不足,细胞聚集成团,无法分清细胞边界,难以进行形态学观测。同时用单一的胰酶消化心肌组织,容易造成心肌细胞的损伤〔10-12〕。本实验室采用混合消化酶(用浓度为2g/L胰蛋白酶(trypsin)和1g/LⅡ型胶原酶(collagenase)1∶1混合)消化心肌组织。不同实验室采用的分次消化时间从5～8 min不等,我们在试验中发现分次消化时间为8 min时,细胞产量和细胞活力较理想。有的实验室在心肌消化过程中将心肌消化到透明为止,而我们发现随着总消化时间的延长细胞活力呈下降趋势,本实验室将总的消化时间控制在30 min左右。第三,在进行细胞培养时,组织材料来源、培养液、血清、消化酶、手术器械、培养板等,要严格按无菌实验要求准备,培养过程中具体操作的每一步都应严格遵循实验原则和无菌要求。心肌细胞的观察、拍照时间不可过长,频率不可太高,否则能增加污染概率。第四,心肌细胞生长的最适pH值为 7.2～7.4,因此培养液、胰蛋白酶、DHank′s液pH值均应在此范围内。当pH低于6.8时,对心肌细胞生长会有抑制作用;当pH值大于7.6时,心肌细胞生长亦会受到抑制,且搏动会减弱。第五,心肌细胞的接种密度不仅影响分离细胞的分化表型特征,而且影响心肌细胞的生存时间。心肌细胞之间联系可促进细胞自发活动的形成。如果心肌细胞接种密度太低,细胞间难进行信息交流,细胞生长不良、细胞难于生存;如果细胞密度太高,则易发生营养不良,且许多细胞难于贴壁生长,在更换培养液时容易被丢失〔13-14〕。本试验的心肌细胞接种密度为5×105细胞/mL,细胞生长良好,收缩明显而有力,用显微镜可以看到搏动细胞。第六,不同组织来源的细胞其生长所需要的营养物质不同。本实验室在培养仔猪原代心肌细胞时,曾用过高糖DMEM、低糖DMEM细胞培养液,发现用这两种培养液培养仔猪原代心肌细胞时,细胞生长缓慢、成活率低、细胞形态不佳等缺点。后来换CMM 6201心肌专用培养液后,细胞形态、生长速度、成活率都明显变好。综上所述,本研究介绍的仔猪心肌原代细胞培养方法,细胞贴壁快、搏动早、产量高,活力好而且操作简便,是一种较为理想的心肌细胞原代培养方法。

据报道,近年来猪口蹄疫逐步表现出发病率平稳,但死亡率却趋于增高的态势,尤其是自1998、1999年起个别地方发病猪与先前的病猪比较在流行特点、临床表现及病情控制等方面都有了相当大的变化。最大的特点是：(1)仔猪发病由先前的肠炎、心肌炎到现在的心肌炎比率增大,而且心肌炎的发病群体也有所扩大,育肥猪心肌炎的死亡率升高;(2)无明显的口蹄疫症状,这就使得病猪在强应激或药物注射后迅速死亡,给养殖户造成了较大的经济损失,同时也延误了对口蹄疫的有效预防时机。

病毒性心肌炎,致病机制主要为：(1)病毒对心肌直接损伤;(2)由于心肌细胞内在感染病毒后免疫反应所致〔15〕。本试验首次培养仔猪心肌原代细胞并接种口蹄疫病毒进行敏感性试验。结果证实长白仔猪的心肌原代细胞对口蹄疫O型乳鼠 适应毒MF6(O/China/99)比较敏感。说明该原代心肌细胞可以作为研究口蹄疫感染诱发仔猪心肌炎致病机理的细胞模型。同时用生长良好的原代细胞接种该O型口蹄疫乳鼠适应毒(MF6),从第2代可以观察到比较典型的口蹄疫致细胞病变(CPE),且随着传代次数的增加病变时间和收毒时间缩短。传至第6代收毒时间在20h左右,14h出现典型病变(CPE)。用国家口蹄疫参考实验室生产的间接红细胞凝集试剂盒和口蹄疫夹心ELISA抗原定型试剂盒检测,可以检测到O型口蹄疫病毒抗原,这就说明O型口蹄疫病毒可以在仔猪原代心肌细胞内增殖,造成心肌细胞的损伤。

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