应用16S rDNA克隆文库筛查腹泻病暴发病原体及特异毒力基因验证*

黄新蓉,刘 劼,叶长芸

2.湖北省黄冈市妇幼保健院,黄冈 436100;

3.传染病预防控制国家重点实验室,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京 102206

感染性腹泻病(Infectious diarrhea diseases)是目前世界性的公共卫生问题〔1〕,是一组由多种病原体引起的以腹泻为主要症状的疾病,这些病原体包括细菌〔2〕、病毒〔3〕和寄生虫〔4〕,成人主要以细菌性和寄生虫性腹泻为主,儿童主要以病毒性腹泻为主〔5〕。目前,引起感染性腹泻病的细菌主要有大肠杆菌属(包括传统的大肠埃希菌、志贺菌以及新近出现的O157 ∶H7 大肠杆菌〔6〕)、沙门氏菌属 、霍乱弧菌 、金黄色葡萄球菌属(产肠毒素型)等。长期以来,对于腹泻患者的临床细菌学检测主要是分离粪便标本中的沙门氏菌、志贺菌、霍乱弧菌等腹泻病原菌,然而,由于大多数患者发病后很快使用抗生素,而使细菌的分离培养结果不理想。同时,对一些新出现的腹泻病原菌可能目前还没有成熟的方法进行分离培养。因此,传统的粪便细菌学检验方法已不能满足诊治的要求。近年来,16S rDNA克隆文库作为一种不依赖于细菌培养、适合于在细菌种群多样性体系中快速筛查疑似病原菌的新技术而引人关注。

传染病预防控制国家重点实验室经过反复试验,建立了一套较完善的16S rDNA细菌学检测技术平台,该平台适用于不同部位的标本,如粪便、痰液等〔7-8〕。本研究以该技术平台为基础,对某地腹泻病暴发的病原体进行了筛查,并对筛查的结果进行了验证。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1研究对象 2006年7月,某地突然暴发100余例腹泻病,当时实验室没有检测到明确的病原体,因此,确定本次为不明原因腹泻病暴发。本研究共收集到12例腹泻患者的粪便标本,随机抽取3例进行粪便总细菌16S rDNA检测。3例腹泻患者的基本资料为：1男,25岁,发病于2006年7月15日,2女,分别为46岁和 26岁,发病于2006年7月16日和18日。

1.2 方法〔7-8〕

1.2.1 标本采集 取腹泻患者的水样便或脓血便10g置于30ml无菌管中,加入磷酸盐缓冲液(pH 7.2)15ml,振荡混匀,200 r/min离心10min,弃掉沉渣,混悬液振荡混匀,-20℃保存。

1.2.2 核酸提取 从-20℃冻存的试管中取200μ l水样便或脓血便,按 QIAamp DNA Stool Mini Kit说明书提取粪便中的总细菌基因组。

1.2.3 引物设计 引用文献上常用的27F-519R引物〔9〕,引物序列为上游引物(27F)：5'-aga gtt tga tcy tgg yty ag-3',下游引物(519R)：5'-gwa tta ccg cgg ckg ctg-3',简并碱基的含义为：y代表t或c,w代表a或t,k代表 g或t。

1.2.4 PCR反应体系和反应条件：含Mg2+10×buffer 5μ L,10mmoL/l dNTPs 3μ L,正反向引物(浓度均为 10mmol/L)1μ L,混合酶(Taq：pfu=4 ∶1)5U,BSA(1mg/ml)5μ L,DNA 模板 100ng,加灭菌去离子水至总体系50μ L。反应条件：95℃预变性5min;95℃30s,58℃ 30s,72℃1 min,30个循环;72℃10 min。

1.2.5 连接、转化和克隆子筛选 将PCR纯化产物与T载体16℃水浴连接16 h,转化JM109感受态细胞,并设空白对照和阳性对照。根据α-互补的原理进行克隆子蓝白斑筛选,每份标本随机挑选150个左右的白色克隆接送测序公司测序。

1.2.6 序列比对与分析 将得到的有效序列在网上进行Blast比较,根据比对结果判定每一个序列所对应的细菌,其判定标准为：1)取相似性(Identities)最高者;2)同一菌属的相似性≥97%;3)当相似性最高者为 Uncultured bacteria,但在相似性 ≥97%中存在已知菌属时,选择已知菌属作为比对结果。数据库建立和统计图绘制使用SPSS 14.0。

1.2.7 粪便标本中志贺菌的验证 对用16S rDNA技术检测到志贺菌属的粪便标本,用志贺菌的特异性毒力基因ipaH引物进行两次PCR扩增,取第一次PCR产物1μ L作为第二次PCR的模板。ipaH引物序列〔10〕为上游引物(ipaHF)：5'-tgg aaa aac tca gtg cct ct-3',下游引物(ipaH R)：5'-cca gtc cgt aaa ttc att ct-3'。预期PCR产物大小为420bp。

1.3 主要试剂与仪器 T-easy载体购自Promega,Taq酶、pfu酶、dNTPs、JM109感受态细胞购自Takara公司,粪便核酸提取试剂盒、质粒提取试剂盒、PCR产物胶纯化试剂盒等购自QIAGEN公司,IPTG、X-Gal购自Sigma公司。引物合成和测序均在上海生物工程有限公司进行。PCR仪为型号为PE 9600。

2 结 果

2.1 细菌分离培养结果3例患者的粪便标本志贺菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌的培养结果均为阴性。

2.2 16S rDNA检测结果

2.2.1 1号患者16S rDNA检测结果共提交130条有效序列,其粪便标本中的菌群分布如图1所示。

2.3 志贺菌特异性毒力基因验证结果 对以上3例标本进行志贺菌的特异性毒力基因iapH检测,结果见图4。

2.4 12例腹泻标本中志贺菌的检出率 用针对志贺菌的特异基因iapH的引物对其它9份腹泻粪便标本进行PCR检测,共检出6份阳性,总的检出率为66.7%(8/12)。

3 讨 论

目前,人类对肠道细菌的认识主要来自分离培养〔11〕,正常人群粪便标本的细菌数为 1012个菌细胞/g干便〔12-13〕,人的胃肠道寄居有400～500种细菌〔11〕,但约有60%～80%的胃肠道细菌是不可培养的〔12-13〕,因而影响了对肠道菌群的正确认识。虽然随着培养基的不断改进和新的细菌自动鉴定仪器的使用,以及对病毒性腹泻和寄生虫性腹泻病原体的认识加深,腹泻病原体的检出率不断提高,但仍有相当部分细菌性腹泻难以查明病因,一方面是由于标本采集前可能已经使用抗生素,使致病菌达不到分离培养的数量,另一方面可能是由于新的病原菌引起。自 1996年 Wilson KH〔14〕用 16S rDNA 基因克隆文库的方法分析一个正常人的结肠菌群以来,有不少关于16S rDNA菌群分布的研究,但研究对象大多是健康人或慢性疾病患者〔15-16〕,如 Antonia Suau等〔17〕分析了一个健康成年男子粪便标本的284个克隆子,发现了许多新的细菌核酸种类,提示了粪便标本中细菌的多样性和16S rDNA基因克隆检测未知细菌的可能性。

利用16S rDNA基因克隆文库的方法可能从种类繁多的微生物群中得到病原菌的信息提示。本研究所涉及的某地腹泻病暴发,粪便标本采集时大多数患者都经过2～3 d的抗生素治疗,实验室培养没有检测到明确的致病菌。在未明原因的情况下,随机抽查3例患者进行16S rDNA基因检测,发现3例患者的菌群分布基本一致,第一优势菌均为Ruminococcus(瘤胃菌属),该细菌属于肠道正常菌群,其主要作用是分解纤维素,有利于食物的消化。瘤胃菌属成为3位腹泻患者的第一优势菌群,其主要原因可能是患者使用抗生素以后,致病菌受到了抑制。在2号患者和3号患者的粪便标本中都筛到志贺菌或大肠杆菌,志贺菌是腹泻的致病菌,因此,16S rDNA克隆文库筛查的结果提示志贺菌可能是导致某地腹泻暴发的原因。进一步用志贺菌的特异性毒力基因ipaH进行PCR检测,在2号患者和3号患者中均检测到了志贺菌核酸,验证了16S rDNA克隆文库的筛查结果。在所有收集的12份标本中,志贺菌检出标本占66.7%(8/12),因此,志贺菌可能是本次腹泻病暴发的主要病原体。16S rDNA克隆文库筛查结果显示,3号标本志贺菌在粪便细菌组成中占3.4%(5/149),2号标本只占0.6%(1/154);志贺菌iapH基因的检测结果显示,在相同的PCR反应体系和反应条件下,3号标本ipaH基因的PCR条带明显比2号标本的亮,说明3号标本的志贺菌基因组在粪便总细菌基因组中所占的比例比2号标本高,与16S rDNA克隆文库筛查的结果一致。因此,16S rDNA基因克隆文库的检测结果基本能反映菌群组成的比例,经特异性毒力基因的验证,其筛查的结果比较可靠。

在传统分类学上,志贺菌和大肠杆菌分别属于志贺菌属和埃希菌属,但二者的16S rDNA序列相似性大于99%,即用16S rDNA序列分析的方法不能鉴别志贺菌和大肠杆菌,但大肠杆菌多数情况下属于正常菌群,且缺乏ipaH毒力基因,本实验用16S rDNA序列结合ipaH基因的方法证明在12份粪便标本中8份存在志贺菌,排除了大肠杆菌是本次腹泻暴发的原因。

传染病预防控制工作多是应对群体性事件,应用16S rDNA克隆文库研究暴发比散发更容易得到临床和流行病学资料的支持,因人群中多个个体感染同一种病原体,其菌群改变具有相似性,分析起来更有规律,更易发现目标病原菌;同时,相同病例多,从身体其它部位(如血液、组织等)检测到细菌的机会增多;多种支持证据是确证病原菌的重要条件。因粪便标本菌群组成复杂,细菌相互之间及与宿主之间关系复杂,腹泻的原因又多种多样,用16S rDNA基因文库分析肠道菌群,在大海捞针般的病原菌搜索中,可起到定位和导航的作用,是一种较好的筛查方法。然而,该方法也受到很多因素的影响(如不同病程患者粪便中的致病菌数量不同,粪便细菌基因组的提取等),且工作量大,费用昂贵,因而实际中很难进行大样本的操作。因此,要利用16S rDNA克隆文库筛查及确证有菌部位标本中的病原菌,尚需大量的经验和各种相关资料的支持。

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