负重训练和补充大豆多肽干预大鼠骨骼肌衰老过程的实验研究

刘丰彬，赵 斌，闫万军，马炳存

负重训练和补充大豆多肽干预大鼠骨骼肌衰老过程的实验研究

刘丰彬1，赵 斌2，闫万军2，马炳存2

目的：探讨负重训练和补充大豆多肽干预大鼠骨骼肌衰老过程的作用效果。方法：56只雄性SD大鼠随机分为7组：成年组，模型组，D-半乳糖小负重组，D-半乳糖大负重组，D-半乳糖补肽组，D-半乳糖补肽小负重组，D-半乳糖补肽大负重组。6周后处死大鼠，制作冰冻切片，测试血清以及骨骼肌各项指标。结果：与成年组相比，模型组大鼠体重和每日摄食量分别呈现升高和下降的趋势，负重和补肽可以在一定程度上缓解两种趋势，但都无统计学意义；模型组大鼠骨骼肌细胞出现萎缩和退行性改变等衰老的迹象，负重和补肽可以在一定程度上减轻这种现象；模型组大鼠血清SOD、SOD/MDA比值和骨骼肌总蛋白含量显著低于成年组，血清MDA显著高于成年组，运动和营养干预各组显著逆转这种趋势，并有明显的交互作用；与成年组相比，模型组大鼠骨骼肌脂褐素含量显著升高，负重或补肽可以一定程度上缓解或逆转这种趋势，两种具有明显的交互作用。结论：负重训练或补充大豆多肽均可以有效的预防大鼠骨骼肌衰老过早的出现，两种方式联合运用效果更为明显。

负重训练；大豆多肽；骨骼肌；D-半乳糖；衰老

随着全世界老龄化国家增多，老龄人口比率加大，人口的老龄化已经成为许多国家都要面对的新的突出的社会问题。对衰老和抗衰老的研究历来都是国际性的医学课题，寻找有效的抗衰老药物和方法，以求得预防衰老过早出现已成为当前老年医学领域中的研究热点。而与人体运动密切相关的骨骼肌衰老的研究也逐渐受到体育科研人员的重视[1-4]。

本研究运用衰老研究中常用的D-半乳糖皮下注射的方法，建立大鼠亚急性骨骼肌衰老模型，并选取负重训练和补充大豆多肽两种方式在大鼠骨骼肌衰老形成过程中进行运动和营养干预，通过观察各组相关指标的变化，分析负重训练和补肽预防骨骼肌衰老过早出现的作用效果，为下一步初步探讨其可能的机制和进行相关后续研究积累一定的理论和实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SD纯系雄性健康大鼠56只，3月龄，平均体重300 g左右，清洁级，由河北省动物实验中心提供。大鼠分笼饲养，每笼3～4只，每天自然光照，自由饮水摄食。动物饲料选用国家标准啮齿类动物混合饲料，由河北省动物实验中心提供。

大鼠购回后适应性饲养一周，称重，编号，随机分7组，各组间动物体重无显著性差异。分组情况见表1。

表1 各组大鼠生活与运动方式

1.2 动物模型建立及各组动物具体处理

参考吴国明等[5]的方法进行D-半乳糖亚急性骨骼肌衰老模型的复制，D-半乳糖用生理盐水配成5%的溶液，按200 mg/kg每天颈背部皮下注射，每天一次，周日不间断，连续6周。

大鼠进行跑台无负重适应性训练一周，然后负重适应性训练一周。正式跑台负重训练方案参考Bedford等[6]和闫万军等[7]的方法，跑速15 m/min，坡度0°，跑2 min，休息2 min为一组，每天连续训练6组，每天一次，周日休息，共6周。负重重量采用大鼠最大负重的百分比来计算（预实验中已经将SD大鼠的最大负重能力进行了测试，约相当于其体重的60%），小负重相当于其最大负重30%，大负重相当于其最大负重70%。

需要灌胃各组大鼠经平衡膳食3天后开始适应性训练，大豆多肽主要含五肽、六肽和八肽，分子量在200～600道尔顿之间。经质谱法测定多肽的氨基酸序列为：（1）Leu Ala Pro Glu（2）Met Ser Leu Pro Thr Asn（3）Arg Leu Met Leu His Leu Ala Pro。正式训练开始后补充大豆多肽组开始灌胃，每次运动后30 min内进行，每日一次，周日不间断，连续6周，灌胃剂量按照0.15 g/100 g体重，大豆多肽溶液浓度为15%，运动对照组灌胃等量生理盐水[8]。

1.3 动物取材及样本处理

实验6周末，最后一次运动后所有组大鼠禁食12 h进行取材。所有取材器械均经过高压灭菌消毒并高温（200℃）烘烤6 h。

腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液（50 mg/kg体重）麻醉，心尖取血，-30℃保存。待测血清生化指标。

取右侧部分股四头肌股直肌，先经异戊烷处理，再用液氮冻干，-70℃冰箱保存，待做骨骼肌冰冻切片。

取少许左侧腓肠肌组织，按照1：9（W/V）的比例加入4℃生理盐水，然后在冰浴中电动匀浆，超声粉碎，4℃离心取上清，-30℃保存待骨骼肌组织生化指标。

1.4 测试指标及方法

1.4.1 一般指标 体重：每周日和处死取材前称量大鼠体重。摄食量：每天记录大鼠摄食量。摄食量＝投食量－剩余量。

1.4.2 组织病理学指标 骨骼肌组织经异戊烷处理液氮冻干制作冰冻切片，7 μm厚连续切片，常规HE染色，每个骨骼肌标本连续切片5张，随机抽取1张在光学显微镜下观察骨骼肌组织病理学改变。组织学的观察和评定由河北医科大学附属以岭医院病理科教授进行，采取单盲法，观察者不了解实验内容。

采用OLYMPUS CX21光学显微镜在放大200倍的情况下进行观察，采用Leica IM50 image manager V1.20对每张切片进行分析，并记录每一组切片中出现组织异常像的频数。骨骼肌组织出现以下情况之一即可确定为组织病理学异常：肌纤维圆形化、细胞核中心化、小角化纤维、小群肌纤维萎缩等[9]。

1.4.3 血清指标 血清超氧化物歧化酶（SOD）采用黄嘌呤氧化酶法，血清丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸法，分别在紫外可见分光光度计上按照试剂盒说明要求测试。

1.4.4 骨骼肌组织匀浆指标 骨骼肌组织总蛋白含量测定，采用考马斯亮蓝法，在紫外可见分光光度计上按照试剂盒说明要求测试。骨骼肌组织脂褐素含量测定，采用荧光比色法，在荧光分光光度计上按照试剂盒说明要求测试。

1.5 统计学处理

所有实验数据用平均值±标准差（M±SD）表示，用SPSS for Windows 11.5统计软件作进一步的分析。针对单一因素对指标的影响，多组间数据如果方差齐，进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），如果有显著性差异，则用S-N-K法进行多重比较；如果方差不齐，则进行自然对数转换或者进行秩和检验。各研究因素对实验指标的主效应以及各因素间交互作用对指标的影响，采用双因素方差分析。显著性水平为P<0.05，非常显著性水平为P<0.01。

2结 果

2.1 体重和摄食量变化

如表2、图1所示，各组大鼠原始体重无显著性差异（P＞0.05）；6周训练后各组大鼠体重都呈现自然增长的趋势，B组大鼠体重低于M组和C组，差异显著（P<0.05）。通过双因素方差分析，负重训练或补充大豆多肽可以使D-半乳糖衰老大鼠体重增长幅度趋缓，但无显著性差异（P＞0.05）。负重训练联合补充大豆多肽对D-半乳糖衰老大鼠体重增长无显著的交互作用（P＞0.05）。

表2 体重和每日摄食量变化（n=8）Table 2 Changes of bodyweight and quotidie ingestion

图1 各组大鼠实验过程中体重变化Figure 1 Changes of per groups of rats body weight in experiment time

如表2、图2所示，各组大鼠每日摄食量无显著性差异（P＞0.05），但都呈现下降的趋势，与C组相比其余各组每日摄食量下降的趋势更为明显。提示：随着造模时间的不断延长，各组大鼠衰老的程度不断加深，导致每日摄食量的不断下降。

通过双因素方差分析，负重训练或补充大豆多肽可以使D-半乳糖衰老大鼠每日摄食量下降幅度趋缓，但无显著性差异（P＞0.05）。负重训练联合补充大豆多肽对D-半乳糖衰老大鼠每日摄食量的变化无显著的交互作用（P＞0.05）。

图2 各组大鼠实验过程中每日摄食量变化Figure 2 Changes of per groups of rats quotidie ingestion in experiment time

2.2 骨骼肌组织病理学观察

光镜下观察C组大鼠为正常骨骼肌组织学特征（见图3）。除C组外其余各组大鼠股四头肌肌细胞形态有着不同程度的改变，主要表现为肌细胞不同程度的萎缩或退行性改变，并且以M组变化最为明显，PB组和PS组萎缩或退行性改变的程度相对较轻。如图4-图9所示：肌纤维萎缩的组织学表现——肌纤维圆形化、细胞直径的差别增大，细胞核中心化等[9]。

本研究采取临床病理学中通用的方法对组织像异常的例数进行了统计，而不是对每组出现异常肌纤维的个数进行统计。（见表3）。

表3 各组大鼠肌细胞异常组织像出现频数（n=8）Table 3 The number of abnormality tissue in per groups of rats muscle cell

结果提示：6周D-半乳糖皮下注射复制亚急性骨骼肌衰老模型，可以造成大鼠骨骼肌细胞出现萎缩和退行性改变等衰老的迹象，负重训练和补充大豆多肽可以从一定程度上减轻萎缩和退行性改变的程度。

图3 C组大鼠股直肌组织切片（HE染色，×200）正常骨骼肌组织结构Figure 3 Light microscopy for musculus rectus femoris tissue from a rat in group C，H&E staining，×200，normal skeletal muscle histology.

图4 M组大鼠股直肌组织切片（HE染色，×200）肌纤维圆形化（粗箭头）细胞核中心化（细箭头）

Figure 4 Light microscopy for musculus rectus femoris tissue from a rat in group M，H&E staining，×200，Round of muscle fiber（thick arrow），Center of cell nucleus（thin arrow）.

图5 S组大鼠股直肌组织切片（HE染色，×200）肌纤维圆形化（粗箭头）细胞核中心化（细箭头）Figure 5 Light microscopy for musculus rectus femoris tissue from a rat in group S，H&E staining，×200，Round of muscle fiber（thick arrow），Center of cell nucleus（thin arrow）.

图6 B组大鼠股直肌组织切片（HE染色，×200）肌纤维圆形化（粗箭头）细胞核中心化（细箭头）Figure 6 Light microscopy for musculus rectus femoris tissue from a rat in group B，H&E staining，×200，Round of muscle fiber（thick arrow），Center of cell nucleus（thin arrow）.

图7 P组大鼠股直肌组织切片（HE染色，×200）肌纤维圆形化（粗箭头）细胞核中心化（细箭头）Figure 7 Light microscopy for musculus rectus femoris tissue from a rat in group P，H&E staining，×200，Round of muscle fiber（thick arrow），Center of cell nucleus（thin arrow）.

图8 PS组大鼠股直肌组织切片（HE染色，×200）肌纤维圆形化（粗箭头）Figure 8 Light microscopy for musculus rectus femoris tissue from a rat in group PS，H&E staining，×200，Round of muscle fiber（thick arrow）.

2.3 血清SOD活力和MDA含量比较

如表4所示：与C组相比，M组大鼠血清中SOD活力显著下降（P<0.05），MDA含量显著上升（P<0.01），从而导致SOD/ MDA显著降低（P<0.01）。通过双因素方差分析，负重训练或补充大豆多肽均能使D-半乳糖衰老大鼠血清中SOD活性显著升高（P<0.05），以S组表现更为明显，MDA含量显著降低（P< 0.05），以P组表现更为明显，从而使SOD/MDA显著升高（P< 0.05）；负重训练联合补充大豆多肽可使D-半乳糖衰老大鼠血清中SOD活性进一步升高（P<0.05），以PS组表现更为明显，MDA含量进一步降低（P<0.05），以PB组表现更为明显，从而使SOD/MDA显著升高（P<0.05），两者具有显著的交互作用。

2.4 骨骼肌组织脂褐素含量比较

如表5所示：与C组相比，M组大鼠骨骼肌组织中脂褐素含量显著升高（P<0.01）。通过双因素方差分析，负重训练能使D-半乳糖衰老大鼠骨骼肌中脂褐素含量有下降的趋势，但无显著性差异（P>0.05），补充大豆多肽则能使脂褐素含量显著下降（P<0.05），以P组表现更为明显；负重训练联合补充大豆多肽可使D-半乳糖衰老大鼠骨骼肌组织中脂褐素含量进一步降低（P<0.05），以PS组表现更为明显，两者具有显著的交互作用。

表5 骨骼肌组织脂褐素含量比较（n=8）Table 5 Changes of skeletal muscle Lipofuscin

2.5 骨骼肌组织总蛋白含量比较

如表6所示：与C组相比，M组大鼠骨骼肌组织中总蛋白含量显著下降（P<0.05）。通过双因素方差分析，负重训练或补充大豆多肽均能使D-半乳糖衰老大鼠骨骼肌中总蛋白含量显著升高（P<0.05），以S组表现更为明显，负重训练联合补充大豆多肽可使D-半乳糖衰老大鼠骨骼肌组织中总蛋白含量进一步升高（P<0.05），以PS组表现更为明显，两者具有显著的交互作用。

表6 骨骼肌组织总蛋白含量比较（n=8）Table 6 Changes ofskeletalmuscle totalprotein

3 讨论与分析

衰老是一个多因素、复杂的综合生理变化过程，是个体成长过程中必然出现的阶段。目前对于干预衰老主要集中在药物研究上，尽管药物干预有一定的临床效果，但是同时又存在着作用局限、有毒副作用等不足。而运动和营养作为两种更为经济和安全的方式，会使机体各器管、各系统的功能产生良好的效应，从而对衰老产生积极的影响[10-12]。

针对运动干预衰老的研究，国内外已有相关的报道，但多数研究是对人体整体机能的调节和影响，指标也较为单一，缺少针对某一器官和组织，尤其是缺少运动抗骨骼肌衰老的机理及综合指标的研究，选择形式也以有氧运动或短期力量训练为主，针对骨骼肌衰老过程中进行相关的抗阻力量训练或负重训练的干预，还没有见到相关文献的报道[13-15]。国内外针对营养干预衰老的研究也较多，相关的营养补剂产品也层出不穷，但从多个层面入手，观察长期补充大豆天然提取物大豆多肽对骨骼肌衰老的影响效果，国内外还没有见到相关文献的报道[16-19]。

本研究参考吴国明等的方法，运用临床医学关于衰老研究中常用的D-半乳糖皮下注射的方法，建立大鼠亚急性骨骼肌衰老模型。借鉴我们以往的研究成果[6，20]，采用在大鼠背部捆绑重物的方式模拟人体的抗阻训练，参考预实验和人体力量训练的原则，确定了大鼠负重训练的重量、周期和频率，最终确定了我们本实验的动物训练方案。而补充大豆多肽的方式和方法则是在充分参考前人研究成果的基础上，结合预实验结果和动物营养干预实验中的原则，最终确定了本实验的动物营养干预方案[21-22]。

研究表明：随着年龄的增长，机体通常会出现脂类代谢紊乱，而这种紊乱可导致体重增加[23]。本研究的结果显示：各组大鼠体重都呈现自然增长的趋势，与成年对照组相比，M组大鼠体重呈现先降后升的趋势，负重训练组和补充大豆多肽组大鼠与M组大鼠的体重虽然没有统计学差异，但却使其大鼠体重增长幅度趋缓，并且以负重训练组的作用更为明显。提示：可能是由于随着造模时间的延长，衰老程度加深，导致脂肪代谢紊乱，负重训练和补充大豆多肽的干预的都可以从一定程度上缓解这种紊乱的情况。实验结束时，虽然M组大鼠体重仍然维持在较高水平，但与对照组大鼠体重比较也没有统计学差异，其原因可能与体脂增加而瘦体组织减少有关。

本研究发现，与C组相比，造模各组每日摄食量虽然无显著性差异，但都呈现下降的趋势，并且以M组的趋势更为明显。提示：随着造模时间的深入，机体代谢紊乱不断加重，各组大鼠衰老的程度不断加深，导致每日摄食量的不断下降。负重训练和补充大豆多肽两种干预手段可以使衰老大鼠每日摄食量下降幅度趋缓，但无显著性差异，并且与单纯负重训练组相比，补充大豆多肽组每日摄食量始终处于较低水平。提示：运动和营养干预可以在一定程度上纠正机体代谢紊乱的情况，减轻大鼠衰老的程度，增加能量消耗，从而提高每日摄食量，并且由于体外营养的额外补充，使补充大豆多肽组每日摄食量减少的更为明显。

组织病理学认为，细胞是生物有机体功能与结构的最小单位，有机体的衰老最终是由于细胞衰老导致的[8]。肌细胞是有机体内最大的细胞，衰老在骨骼肌组织病理学水平也应有所变化和表现。从实验结果来看，与C组相比，M组组织学变化明显，所有大鼠都不同程度出现了肌纤维圆形化、细胞直径的差别增大、细胞核中心化等肌细胞初步萎缩或退行性改变的表现，负重组和补肽组较M组变化程度减轻，并以PB组和PS组萎缩或退行性改变的程度最轻，各组大鼠肌细胞异常组织像出现频数的分析也证明了此趋势。可以判断，6周D-半乳糖皮下注射复制亚急性骨骼肌衰老模型，可以造成大鼠骨骼肌细胞出现萎缩和退行性改变等衰老的迹象，同时进行的负重训练和补充大豆多肽的干预，可以从一定程度上预防这种骨骼肌萎缩和退行性改变的程度过早出现。

许多研究将有机体内最重要的抗氧化酶SOD活力和脂质过氧化的降解产物MDA的含量作为反映机体衰老程度的指标[23-24]。而组织中沉积的脂褐素被认为是最能反映组织本身衰老的标志物，被称为判断组织衰老的黄金指标[25]。本研究的结果来看，6周D-半乳糖皮下注射，可以使M组大鼠血清中SOD活力显著下降，MDA含量显著上升，SOD/MDA显著降低，骨骼肌脂褐素含量显著升高。提示：此时大鼠机体已经出现自由基代谢紊乱的情况，正在处于衰老的状态，这与国内外的报道一致[24，26]。两种干预方式均能使这种情况得到逆转，提高血清中SOD活力，降低MDA含量，从而提高SOD/MDA比值，降低骨骼肌脂褐素的含量。负重训练联合补充大豆多肽对自由基清除有明显的交互作用，并且比单一干预因素的作用效果更为明显。提示：两种干预方式可以有效提高机体的抗氧化能力，减少自由基的生成，修复自由基增多造成的机体损伤，减轻大鼠机体衰老的程度，一定程度上可以达到预防衰老过早出现的作用。

骨骼肌总蛋白含量从总体上反映了骨骼肌蛋白质代谢的状况，对于评价骨骼肌的功能具有十分重要的作用。随着年龄增加，骨骼肌蛋白更新率下降，骨骼肌中蛋白质合成减少而分解增加，最终导致衰老机体骨骼肌蛋白含量的减少。本实验的结果显示：6周D-半乳糖皮下注射，可以使M组大鼠骨骼肌组织总蛋白含量显著降低，这与以往的研究成果相一致。提示：随着造模时间的延长，大鼠衰老的程度加深，骨骼肌内自由基积累增多，肌蛋白分解增加，导致骨骼肌组织总蛋白含量的降低。运动和营养两种干预方式均可以有效提高大鼠骨骼肌组织总蛋白的含量，两者的交互作用明显，比单一干预因素作用效果更为明显。提示：负重训练和补充大豆多肽两种干预方式可以有效提高骨骼肌本身的抗氧化能力，减少骨骼肌自由基的生成，纠正骨骼肌组织蛋白质合成代谢与分解代谢的不平衡，减轻大鼠骨骼肌的衰老程度。

4结 语

在本实验条件下，6周D-半乳糖皮下注射，可以成功复制大鼠亚急性骨骼肌衰老模型。造模的同时进行负重训练或补充大豆多肽的干预，均可以有效的预防6周D-半乳糖造模过程中大鼠骨骼肌衰老过早的出现，而且两种方式联合运用效果更为明显。其作用机制可能与减少机体中自由基生成，减轻骨骼肌脂质过氧化程度，减少骨骼肌组织脂褐素的沉积等有关。

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The Experimental Study of the Intervention in Skeletal Muscle Aging Process by Weight Training and Soy Polypeptide Supplement

LIU Fengbin1,ZHAO Bin2,YAN Wanjun2,MA Bingcun2
(1.School of PE,Dalian University,Dalian 116622,China;2.School of PE,Hebei Normal University,Shijiazhuang 050016,China)

Objective:To study the effect of the intervention on skeletal muscle aging process by weight training and soy polypeptide supplement.Method:56 male SD rats were randomly divided into seven groups:adult group,model group,D-galactose small load exercise group,D-galactose big load exercise group,D-galactose peptide group,D-galactose peptide and small load exercise group,D-galactose peptide and big load exercise group.The rats were killed after 6 weeks,made the frozen sections,and tested serum,as well as indicators of skeletal muscle.Results:Compared with the adult group,body weight and quotidie ingestion of rats had upward and downward trends respectively,weight training and soy polypeptide supplement could mitigate two trends in some extent,but they had no statistical significance;There were some aging evidences of atrophy and retrogression change in skeletal muscle cell of model group, weight training and soy polypeptide supplement could mitigate this trend in some extent;Serum SOD,SOD/MDA ratio and skeletal muscle total protein content of model group were significantly lower than the adult group,serum levels of MDA was significantly higher than the adult group,the exercise and nutrition groups could reverse this trend and had evident interaction;Compared with the adult group,model group significantly increased lipofuscin content in skeletal muscle,the weight training or peptide groups could mitigate or reverse this trend,and they had evident interaction.Conclusion:Weight training or soy polypeptide supplement can prevent the premature appearance in skeletal muscle aging effectively,and the two interference ways united can have more obvious effect.

weight training;soy polypeptide;skeletal muscle;D-galactose;aging

G 804.7

A

1005-0000（2010）01-0033-05

2009-11-02；

2009-12-25；录用日期：2009-12-31

河北省自然科学基金项目（项目编号：C2008000177）；大连大学博士科研基金联合资助项目

刘丰彬（1981-），男，辽宁大连人，博士，大连大学讲师。

1.大连大学体育学院，大连116622；2.河北师范大学体育学院，石家庄050016。