产纤维素酶细菌菌株 Z1发酵条件优化

胡青平

(山西师范大学生命学院,临汾 041004)

产纤维素酶细菌菌株 Z1发酵条件优化

胡青平

(山西师范大学生命学院,临汾 041004)

以本实验室分离的产纤维素酶细菌菌株 Z1为研究对象,采用单因素试验、正交试验、方差分析和多重比较,研究了碳源、氮源、温度、初始 pH等因素对 Z1菌株产纤维素酶活力的影响,确定了其产纤维素酶的最优条件组合。结果表明,在此试验范围内,影响 CMC酶的主次因素由大到小依次为碳源、氮源、pH;影响FPA酶的主次因素由大到小依次为 pH、碳源、氮源。菌株 Z1的最优发酵条件为 CMC 2 g,玉米粉 1 g,豆饼粉3 g,pH为 7.0。在此条件下,不仅有较高的纤维素酶活,同时还有较高的蛋白酶活,即 CMC酶活力 132.5 μg/(mL·min),FPA酶活力 93.8μg/(mL·min),蛋白酶活力 46.7μg/(mL·min)。

纤维素酶 细菌 发酵条件

纤维素酶是降解纤维素β-1,4葡萄糖苷键,使纤维素分解成纤维二糖、葡萄糖等可溶性糖的一组酶的总称。该酶己在纺织、日用化工、造纸、食品发酵加工工业等领域得到广泛的应用,并受到各国生物界的关注,期望借助纤维素酶将地球上最廉价、最丰富的可再生资源 -纤维素,转化为能直接利用的能源和资源[1-5]。目前纤维素资源的利用率不仅低,而且对环境会造成一定的污染。因此,如何成功的开发这一资源,对解决人类面临的能源问题、环境问题、可持续发展都具有非常重要的意义[6]。

利用微生物产生的纤维素酶来分解和转化纤维素则是纤维素利用的有效途径[7]。一直以来,纤维素酶的发酵生产都以真菌为主。但真菌纤维素酶的适宜 pH值多为酸性,工业应用步骤繁琐,在很大程度影响了纤维素的酶解效率[8-9]。近年来,随着细菌产生的中性和碱性纤维素酶在工业中的成功应用,细菌纤维素酶制剂已逐渐成为关注的热点。但细菌产纤维素酶的产量较少,主要是葡聚糖内切酶,大多数对结晶纤维素无降解活性,且所产生的酶大多是胞内酶或吸附在细胞壁上,不分泌到培养液中,增加了提取纯化的难度,因此对细菌的研究较少。本试验的研究对象是从自然环境中分离、纯化和培养了的一株经刚果红显色法鉴定的高效纤维素分解细菌菌株 Z1,同时还有产蛋白酶的性能。采用正交设计和统计分析相结合,优化了 Z1菌株的发酵条件,为进一步的生产实践应用提供可能的发酵模式和新的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

山西师范大学微生物实验室分离的一株产纤维素酶细菌菌株,该菌形态杆状,可产芽孢,适宜在 pH值 7.0～9.0、35～40℃条件下生长,为便于研究,将其命名为 Z1。

1.2 培养基

1.2.1 菌种保藏培养基 (g/L)[10]

蛋白胨 10 g,牛肉膏 3 g,NaCl 1 g,琼脂 20 g,pH为 7.0,121℃灭菌 20 min。

1.2.2 CMC-刚果红分离培养基 (g/L)[11]

CMC-Na 1.88 g,刚果红 0.2 g,硫酸铵 3 g,琼脂 20 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,NaCl 0.5 g,K2H PO41 g,pH为 7.0,121℃灭菌 20 min。

1.2.3 液体发酵培养基 (g/L)[10]

CMC 3.0 g,蛋白胨 5 g,NaCl 0.5 g,KH2PO40.1 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,酵母粉 5 g,pH为 7.0, 121℃灭菌 20 min。

1.3 主要仪器与设备

HPX-9272数显电热培养箱:上海博迅实业有限公司;BS-2F数显振荡培养箱:常州菲普实验仪器厂;7200可见分光光度计:龙尼柯仪器有限公司。

1.4 菌株 Z1产纤维素酶能力定性分析

将实验室已分离的纤维素酶菌 Z1三点接种于CMC-刚果红分离培养基,在 35℃的培养箱里放置3 d。观察透明圈的有无和大小。

1.5 产纤维素酶的条件优化

分别改变液体发酵培养基中碳源 (玉米粉、CMC)、氮源(豆饼粉、蛋白胨),并以两种碳源的复配克数 (3.0+0、2.0+1.0、1.5+1.5、1.0+2.0、0+ 3.0 g/L)、豆饼粉 (1、3、5、7、9 g/L)、发酵温度 (25、30、32、35、37、40℃)和初始 pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)为 4个单因素试验,摇床培养 72 h。测定各单因素条件下初酶液的CMC酶活力和 FPA酶活。然后选择其中三个因素 (碳源、氮源和 pH),采用L9(34)正交实验[12],以 CMC酶、FPA酶及蛋白酶活为衡量指标,研究三因素对产酶的主次影响。统计分析软件为DPS v3.01。

1.6 初酶液的制备

液体发酵培养基经 35℃,220 r/min摇床培养72 h,发酵液用 4层纱布过滤,3 000 r/min离心15 min,取上清液备用。

1.7 纤维素酶活测定

CMC酶活力和 FPA酶活力的测定均用 DNS法[9],包括葡萄糖标准曲线的制作。另 CMC酶作用底物用CMC-Na,FPA酶作用底物为滤纸条。酶活力定义参照国家行业标准QB 2583—2003。

1.8 蛋白酶活测定

参照丁鲁华等[13]测定蛋白酶活力的方法。1.0 mL酶液于40℃,pH 7.2条件下,每分钟水解2%酪蛋白溶液产生1 g酪氨酸的量定义为一个酶活力单位。

2 结果与讨论

2.1 菌株 Z1产纤维素酶能力的定性分析

图1 产纤维素酶菌株的定性分析

将 Z1菌株接种于刚果红培养基上培养,结果见图 1。由于刚果红能与纤维素形成红色复合物,而不能与水解后的纤维二糖和葡萄糖形成红色复合物,所以在产纤维素酶菌株周围会出现透明圈,通过测量其透明圈的直径(1.7±0.4)cm。故 Z1是一株产纤维素酶的细菌菌株。

2.2 发酵条件优化

2.2.1 单因素试验

分别改变 Z1菌株液体发酵培养基中碳源、氮源、初始培养 pH和发酵温度,控制其他条件不变,摇床培养 72h。各处理的纤维素酶活力见表 1、图 2、图3、图 4和图 5。

表1 碳、氮源对产纤维素酶活的影响

从表1可知,各处理中 CMC酶活力均高于 FPA酶活,且玉米粉和CMC对 CMC酶活力和 FPA酶活力的影响均无显著差异(P>0.05),而纤维素酶属诱导酶,故在后续试验中考虑用玉米粉和 CMC的复配提高纤维素酶活;豆饼粉和蛋白胨对纤维素酶活的影响也无显著性差异 (P>0.05),为了低成本、更有效的服务于工业发酵生产,故选用豆饼粉为氮源。

从图 2可知,CMC和玉米粉复配对纤维素酶活有一定的影响,其复配克数为 (2+1)g/L时,CMC酶活力和FPA酶活力都达到最高;从图 3可知,当豆饼粉为 5 g/L时,有较高的 CMC酶活力和 FPA酶活力;从图 4可知,初始 pH为 6.5～7.5时, CMC酶活力较高,初始 pH为 7.0,FPA酶活力最高;从图 5可知,小范围的温度变化会引起纤维素酶的大幅度变化,因此,在后续正交试验中,固定发酵温度为 35℃。

2.2.2 正交试验结果

在单因素试验的基础上,保持发酵温度不变(35℃),采用 L9(34)正交试验的方法,研究氮源 (豆饼粉)、CMC和玉米粉的复配比例、pH三个因素对产纤维素酶和产蛋白酶的影响。确定其发酵的主次因素及相互关系。试验结果及统计分析见表 2、表 3和表4。

表2 菌株 Z1正交试验

表3 方差分析

从表2中极差R可知,以 CMC酶活力为衡量指标时,各因素的主次顺序及最优组合为:B2A2C2,且各处理的 CMC酶活力间没有显著性差异 (P> 0.05)。以 FPA酶活力为衡量指标时,各因素的主次顺序及最优组合为:C2B2A1,且各处理的 FPA酶活力间有显著性差异(P<0.05),说明各因素的水平间不能相互替换。以蛋白酶活为衡量指标时,各因素的主次顺序为:B2A2C2,且各处理的蛋白酶活没有显著性差异(P>0.05)。从表 3方差分析和表 4的 SSR多重比较得知,B因素的三水平对三种酶活力的影响均有显著性差异 (P<0.05),而 C因素的水平只对FPA酶活力有显著性差异 (P<0.05)。综合以上分析,首先可以确定的因素水平为 C2B2。对于A因素,对于CMC酶活力和蛋白酶活来说,需选2水平,但考虑到降低成本,我们选用A因素的 1水平,且B2C2A1组合下发酵的三类酶活力均处于较高的水平,即 CMC 2 g,玉米粉 1 g,豆饼粉 3 g,pH为 7.0的条件下发酵时,CMC酶活力 132.5μg/(mL·min),FPA酶活力93.8μg/(mL·min),蛋白酶活力 46.7μg/(mL· min)。

表4 SSR检验

3 结论

主要研究了不同氮源、碳源、不同初始 pH及不同发酵温度对菌株 Z1产纤维素酶活的影响,并通过L9(34)正交试验得出了最优发酵条件组合,即 CMC 2 g,玉米粉 1 g,豆饼粉 3 g,pH为 7.0的条件下发酵时,CMC酶活力 132.5μg/(mL·min),FPA酶活力93.8μg/(mL·min),蛋白酶活力 46.7μg/(mL·min)。试验所确定的 Z1菌株的最优条件组合可以为该菌株的规模化发酵生产纤维素酶蛋白酶提供了一定的理论依据。

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Opti mization of Fer mentation Conditions for Cellulase High-Yield Bacteria Z1

Hu Qingping
(College ofLife Science,ShanxiNormalUniversity,Linfen 041004)

Taking cellulase high-yield strain Z1 from our laboratory as object,the fermentation conditions for strain Z1were optimized.Single factor tests,orthogonal experimental designs,variance analysis and multiple comparisonswere applied to study the effects of influencing factors,carbon source,nitrogen source,temperature and pH,and to op2 timize the fermentation parameters.Results:The effect sequences of three main factors for CMC enzyme activity rank from pri mary to secondary as carbon source,nitrogen source,and pH,and for FPA enzyme activity as pH,carbon source,and nitrogen source.The optimal fer mentation conditions for strain Z1 are CMC 2 g,corn flour 1 g,soybean meal powder 3 g,pH 7.0.Under the optimal fer mentation conditions,strain Z1 has not only high cellulase activity but also high protease activity,i.e.,C MC enzyme activity 132.5μg/(mL·min),FPA enzyme activity 93.8μg/(mL·min) and protease activity 46.7μg/(mL·min).

cellulase,bacteria,fermentation conditions

Q939.97 文献标识码:A 文章编号:1003-0174(2010)09-0111-05

山西省青年基金 (2008021040),山西省软科学项目(2010041031-02),山西师范大学自然基金 (ZR0 9015)

2009-07-15

胡青平,女,1972年出生,博士,副教授,硕士生导师,微生物资源开发应用