响应面法优化红曲霉 X27液态发酵产γ-氨基丁酸工艺条件

叶 砚 蒋冬花 嵇 豪

(浙江师范大学化学与生命科学学院,金华 321004)

响应面法优化红曲霉 X27液态发酵产γ-氨基丁酸工艺条件

叶 砚 蒋冬花 嵇 豪

(浙江师范大学化学与生命科学学院,金华 321004)

基于 P-B法试验的结果,利用响应面法对红曲霉菌株X27液态发酵产γ-氨基丁酸(GABA)的工艺条件进行了优化。Plackett-Burman法确定了红曲霉 X27液体发酵产 GABA的三个主要的影响因素(温度,pH和通气量);然后利用响应面分析方法,确定其最优工艺条件为:34℃,pH 5.5,通气量 120 L/h,其 GA2 BA产量可达 9.18 g/L。

红曲霉 GABA Plackett-Bur man法 响应面法 液态发酵

γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid,GABA)是一种广泛分布于细菌、真菌、藻类和动植物中的非蛋白质氨基酸[1]。研究表明:GABA具有抗焦虑、抗惊厥、降血压、改善脑机能、促进长期记忆、增加神经营养、活化肾、肝功能等多种生理功能[2-4]。此外植物体内的 GABA还参与抵御逆境胁迫反应等作用以及调节花粉管生长和植物生长方向的功能[5-6]。

红曲在我国有着 1 000余年的使用历史,它是一种以大米为原料,经红曲霉发酵生产的一种紫红色的独特米曲,广泛应用于食品工业和疾病治疗,具有降血压、降血脂等作用[7-8]。目前针对红曲霉生物合成 GABA的研究大多采用固体发酵法。而深层发酵具有不易受杂菌污染,发酵中间过程调控方便的优点,更有利于 GABA产量的提高[9]。采用已有的一株产 GABA的红曲霉 X27,利用 Plackett-Burman(P -B)试验设计确定影响其液体发酵产 GABA的三个主要因素,并进一步运用响应面法 (Response Surface Methodology,RS M)分析,确定了其产 GABA的最优生产条件[10]。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

红色红曲霉 (Monascus ruber)X27:浙江师范大学生物技术实验室保存。

KLF200发酵罐:瑞士比欧生物工程公司;M IK2 RO 22R高速冷冻离心机:德国 Hettich公司;Agilent 1200液相色谱仪:Agilent科技公司。

1.2 培养基和培养方法

试管斜面培养基:PDA培养基;

种子培养液:马铃薯 200 g,葡萄糖 20 g,谷氨酸5 g,谷氨酸钠 5 g,酵母浸膏 5 g,氯化锌 1 g,硫酸镁1 g,水 1 000 mL;

发酵培养液:葡萄糖 20 g,磷酸氢二钾 1 g,磷酸二氢钾 1 g,谷氨酸钠 5 g,氯化锌 1 g,硝酸钠 5 g,硫酸镁 1 g,硫酸亚铁 0.01 g,水 1 000 mL。

培养方法:试管斜面接种后,在 30℃的恒温培养箱中培养 7 d至菌丝长满斜面。用 5 mL无菌水洗下斜面孢子,接入装有 50 mL种子培养液的 250 mL锥形瓶中,30℃、200 r/min摇床培养 72 h。将培养好的一级种子液转接入装有 100 mL种子培养液的500 mL锥形瓶中[11],同样条件下培养 48 h制成二级种子后,上罐发酵。

1.3 优化试验设计

利用统计分析软件Minitab 15版进行试验的设计和数据分析。

1.3.1 Plackett-Bur man试验设计

采用Minitab 15软件的 P-B试验设计法,以温度(X1),pH(X2),发酵罐罐压 (X3),通气量 (X4),接种量 (X5),搅拌桨转速 (X6),种子级数 (X7)作为试验因子进行实验设计,GABA浓度 (Y)为响应值,进行 7因子 2水平的 P-B设计,各因子的编码水平和取值如表1所示。

表1 P-B试验设计各因子编码水平与取值表

根据表 1的编码水平与取值,将数据输入Minit2 ab 15运行 P-B试验设计。

1.3.2 最陡爬坡试验设计

最陡爬坡试验以各显著效应值的大小来确定最陡上升路径,而其他因素的取值则根据各因素效应的正负和大小,正效应的因素取较高值,负效应的因素取较低值。根据 P-B试验确定的影响 GABA发酵的主要因素,设计最陡爬坡试验。

1.3.3 RS M试验设计

根据 P-B试验设计的结果进行分析,将对 GA2 BA发酵影响最大的三个因素确定为主要因素,进行RS M试验设计,采用Box-Behnken设计法进行响应面分析。根据所得结果建立回归方程并描述各因子对响应值的影响。

通过对回归方程的方差分析,评价每个因子及其交互作用对响应值的影响程度,并用响应面图直观地描绘结果,同时求出响应值最大时各因子的水平。

1.4 分析方法

GABA含量采用 HPLC进行检测[11-12]。

2 结果与分析

2.1 确定影响红曲 GABA产量的重要因子

表 2 Plackett-Burman设计试验方案及结果

表 3 P-B试验设计因素回归方程系数显著性检验

除以上 3个显著因素外,其他因素的变化对 GA2 BA的发酵产量影响不大,故后续试验采用同一条件:一级种子,罐压 0.3 MPa,接种量 5%,搅拌桨转速 200 r/min。

2.2 最陡爬坡试验

针对温度、pH、通气量 3个因素进行最陡爬坡试验,其中温度为正效应,pH和通气量为负效应,将前者的值逐步增加,后两者的值逐步减小以寻找最大响应区域[13]。试验设计和结果如表 4所示。

表4 最陡爬坡试验设计及试验结果

由最陡爬坡试验可知:在温度32.5℃,pH 5.5和通气量125 L/h的条件下 GABA产量最高,设定温度32.5℃,pH 5.5和通气量 125 L/h为 RS M试验的中心点,据此设计RS M试验。

2.3 RS M优化发酵条件

2.3.1 回归方程建立与方差分析

结合 2.1确定的影响 GABA产量的显著因素及爬坡试验结果,重新定义温度、pH、通气量分别为X1,X2,X3并进行 RS M试验。同时根据效应值设计RS M试验高低水平,见表 5。

表5 RS M试验设计

运用Minitab 15软件设计出 RS M试验 (表 6),以 GABA的产量为响应值,将试验结果输入Minitab 15进行统计学分析,作出相应的图标和数学模型,并根据图表数据进行分析。从结果大体看出随着温度的升高 GABA合成量也在上升,pH的最佳范围在5.5附近,通气量的大小与 GABA产量呈反相关。

表 6 利用Minitab设计出的 RS M试验项目及结果

从表6可见,当温度为32.5℃,pH为5.5,通气量125 L/h的情况下,G ABA的产量最高,为 9.18 g/L。

以 GABA产量为响应值进行分析后,Minitab 15给出的回归系数,建立回归方程如下:

表7 回归分析结果表

根据表 8的数据分析得出可知:失拟不足 (P= 0.213>0.05),而回归方程的 P值小于 0.001,达到极显著,数据分析的结果为:得 X1=34.29,X2= 5.50,X3=119.20,解值为 9.30。即当温度为34.3℃,pH为5.5,通气量为 119.2 L/h时,GABA的发酵值为9.30 g/L。

表8 方差分析表

2.3.2 响应面以及等高线分析结果

响应面图是响应面在各试验因子交互作用下得到的结果构成的一个三维空间曲面。根据回归方程,采用Minitab 15软件回执响应面和等值线图,考察所拟合的响应曲面的形状[14]。图 1～图 3是对响应值G ABA影响最大的三个因素的交互作用的响应面。

图1 GABA关于温度与pH的响应面图

由图 1中可知,当温度在 (30.0,34.3)区间,pH在(5.0,5.5)区间内,GABA的单位产量随着两者的升高而升高,呈现正相关。而当温度在 (34.3,35.0)区间,pH在(5.5,6.0)区间内,GABA的单位产量随着两者的升高而降低,呈现负相关。

图2 GABA关于温度与通气量的响应面图

由图 2可知,当温度在 (30.0,34.3)区间,通气量在(100.0,119.2)区间内,GABA的单位产量随着两者的升高而升高,与两者呈现正相关。当温度在(34.3,35.0)区间,通气量在 (119.2,150.0)区间内, GABA的单位产量随着两者的升高而降低,呈现负相关。

图3 GABA关于pH与通气量的响应面图

由图 3可知,当 pH在(30.0,34.3)区间,通气量在(100,119.2)区间内,GABA的单位产量随着两者的升高而升高,呈现正相关。而当 pH在 (34.3, 35.0)区间,通气量在 (119.2,150.0)区间内,GABA单位产量随着两者的增高而降低,呈现负相关。

将试验数据导入Minitab 15。可知最佳条件是:温度为 34.3℃,pH为 5.5,通气量在 119.2 L/h,此时红曲菌 X27的 GABA产量最高,为 9.30 g/L。

2.3.3 验证试验

为验证试验的可靠性,采用上述最优发酵条件进行 GABA发酵验证试验,考虑到实际操作的便利,将最佳条件修正为温度 34℃,pH 5.5,通气量为 120 L/h,经测定,两次平行试验的 GABA生产量分别为9.16 g/L和 9.21 g/L,GABA平均产量为 9.18 g/L,实测平均值与预测值无显著差别,证明此次 RS M试验参数准确可靠,具有实用价值。

3 结论

Plackett-Burman法确定对红曲菌液体发酵生产 GABA影响重要的三个因素分别是温度,pH和通气量。响应面法优化后的工艺条件为,34℃,pH 5.5,通气量 120 L/h。优化后的 GABA产量达到9.18 g/L,比未优化提高 74.7%。

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Opti mization of Fer mentation Conditions of Monascus X27 for Producingγ2Aminobutyric Acid

Ye Yan Jiang Donghua Ji Hao
(College of Chemistry and Life Sciences,ZhejiangNo rmalUniversity,Jinhua 321004)

Based on the results of a Plackett-Burman design experi ment,showing the most significant influen2 cing factors in biosynthesis ofγ2aminobutyic acid were temperature,pH and ventilation rate,the response surface methodologywas used to optimize the liquid fer mentation conditions for producingγ2aminobutyric acid byM onascus ruberX27.Results:The optimized fermentation conditions for theγ2aminobutyric acid production are 34℃,pH 5.5 and 120 L/h.Under the conditions,the yield ofγ2aminobutyric acid is 9.18 g/L.

monascus,γ2aminobutyric acid,Plackett-Bur man design,response surface methodology,liquid fer mentation

Q939.97 文献标识码:A 文章编号:1003-0174(2010)09-0106-05

浙江省重大科技专项(2007C12036),浙江省自然科学基金(Y3090343)

2009-10-10

叶砚,男,1984年出生,硕士,应用微生物

蒋冬花,女,1964年出生,教授,微生物学与植物病理学