响应面法优化年糕抑菌保鲜剂的研究

刘青梅胡庆松,杨性民郁志芳

(浙江万里学院 宁波市农产品加工技术重点实验室1,宁波 315100)

(南京农业大学食品科学系2,南京 219500)

响应面法优化年糕抑菌保鲜剂的研究

刘青梅1胡庆松1,2杨性民1郁志芳2

(浙江万里学院 宁波市农产品加工技术重点实验室1,宁波 315100)

(南京农业大学食品科学系2,南京 219500)

采用响应面法(RS M)分析了乳酸链球菌素、丙酸钙、乳酸和壳聚糖对年糕腐败菌生长的抑制作用,以探讨抑菌剂对年糕的保鲜效果。结果表明:乳酸链球菌素和乳酸对年糕保鲜的抑菌作用极为显著,二者的交互影响作用也极为显著;丙酸钙对年糕中霉菌的抑制作用较好。壳聚糖浓度影响抑菌剂成膜的厚薄,从而影响到抑菌效果。通过中心组合设计(CCD)试验设计并建立回归模型,经验证回归的拟合程度好。同时得出年糕复合抑菌剂配方为壳聚糖 2%、乳酸 1%、乳酸链球菌素 0.30 g/L、丙酸钙 0.3 g/L,采用该抑菌保鲜液涂膜处理年糕,真空包装后 25℃贮藏 120 d无变质,菌落总数测定 <1 000 cfu/g。

年糕 响应面分析 抑菌剂

年糕 (rice cake)是以粳米为原料,经浸泡、水磨、压榨、蒸煮、挤压成型等工序加工而成的一种传统食品,具有爽滑、香糯的优良品质,深受消费者欢迎。由于年糕是水分含量高,水分活度大的低酸性淀粉制品,很容易因细菌、霉菌和酵母等微生物污染引起年糕腐败变质。外贸出口年糕采用真空包装、高温高压灭菌技术解决年糕保质的问题,虽然年糕经高温高压灭菌,可达到商业无菌,保质期得到了延长,但年糕色泽变黄、质地变硬,难以保持原有的质地和色泽,可谓保质而不保鲜。内销年糕采用常压灭菌(95～100℃,30～50 min),由于灭菌不彻底,容易因细菌、霉菌繁殖而发霉变质,保质期短。有些年糕加工企业仍使用国家禁止的亚硫酸钠来抑制年糕微生物[1]。

本课题组在对年糕保鲜研究中发现,年糕的腐败菌仅生长在年糕表面。因此,试验采用壳聚糖(chitosan)作为载体[2],将对人体无毒副作用的天然防腐剂乳酸、乳酸链球菌素 (Nisin)和丙酸钙在年糕表面涂膜,形成一层防腐保鲜膜,抑制腐败微生物生长繁殖。

乳酸链球菌素是国际上公认安全的防腐剂,是乳酸链球菌产生的一种多肽物质,具有较强杀菌作用的天然代谢产物,能杀死或抑制革兰氏阳性菌,特别是细菌孢子,金黄葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒梭菌等[3-5]。

丙酸钙对霉菌、酵母菌等具有广泛的抗菌作用。可用作食品防霉剂,用于面包及糕点的最大使用量为 2.5 g/kg[6]。

乳酸作为天然的酸味调节剂,在面包、蛋糕、饼干等焙烤食品用于调味和抑菌作用,并能改进食品的品质,延长保质期[7]。

响应面法(RS M)试验设计,是采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系,通过对回归方程的分析来寻求最佳的工艺参数,解决多变量问题的一种统计方式。目前越来越多人采用响应面法来优化工艺参数、优化抑菌剂配比[8-9]。本试验应用响应面法(RS M)设计,采用 design expert软件对数据统计分析,筛选出一种能明显抑制年糕腐败的复合抑菌剂,在年糕生产上具有十分重要的实际意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

年糕:余姚市河姆渡统一精制年糕厂;营养琼脂培养基、马丁氏培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基:杭州微生物试剂有限公司;乳酸链球菌素 (纯度50%):中国银象生物工程有限公司出品;丙酸钙:中国郑州银河食品添加剂有限公司出品;壳聚糖(脱乙酰度 90%):济南海得贝海洋生物工程有限公司;L-乳酸(食品级):郑州天润乳酸有限公司。

1.2 仪器与设备

S W-CJ-I B(u)型超净工作台:苏州净化设备有限公司;LDZX-30KB/KBS型高压蒸汽灭菌锅:宁波江南仪器厂;SPX型智能生化培养箱:宁波江南仪器厂;JLQ-S1型菌落计数器:江苏锡山市金城仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 乳酸链球菌素对年糕中细菌抑制作用的试验

取 1%的壳聚糖溶解在 1%的乳酸溶液中,加入 0.6 g/L丙酸钙,再在上述溶液中分别配制 0.00、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.20、0.30 g/L的乳酸链球菌素溶液。将上述保鲜液分别浸涂在年糕表面,每个处理重复 10次,待涂膜的保鲜液干后,用薄膜袋包装封口,于 25℃恒温箱中放置 5 d,随机抽出 3块年糕(25 g/块)测细菌菌落总数,分析乳酸链球菌素对年糕中细菌的抑制效果。

1.3.2 丙酸钙对年糕中真菌抑制作用的试验

取 2%的壳聚糖溶解在1%的乳酸溶液中,加入0.30 g/L的乳酸链球菌素,在该溶液中分别配制0.002、0.004、0.006、0.008、0.010、0.040、0.080、0.100、0.200、0.300 g/L的丙酸钙配制成保鲜液。将上述保鲜液浸涂在年糕表面,每个处理重复 10次,待浸涂的保鲜液干后,用薄膜袋包装封口,于25℃恒温箱中放置 5 d,计算这 10块年糕中的霉菌菌斑总数,分析丙酸钙对年糕中真菌的抑制效果。

1.3.3 乳酸处理对年糕中微生物的影响

乳酸对微生物的影响十分显著,其对微生物的抑制作用主要是通过降低 pH杀菌和通过自身结构对微生物生长的影响。

在含水量约40%的米粉中添加2%的乳酸溶液,米粉的 pH调节值为 2、3、4、5、6,蒸煮并挤压成型后,按 25 g/袋真空包装后贮藏,分析酸化对年糕中微生物的抑制效果。

1.3.4 复合抑菌剂对年糕中细菌抑制作用的响应面试验

应用响应面法(RS M)原理,采用中心组合(Cen2 tral Composite Design)设计 (即 CCD设计),可减少正交方法设计所需要的试验次数,并缩短试验周期,而且可以通过响应面图和等高线图,直观的得到其所需要的水平。

根据单因素试验结果并参考文献经验值,试验选取对年糕细菌抑制作用的壳聚糖、乳酸、乳酸链球菌素 3个因素为自变量,每个因素取 5个水平,以(-1.68,-1,0、1、1.68)编码,以抑菌率为响应值设计。试验因素水平编码见表 1。

试验结果应用 design expert(version6.0 Stat-Ease Ince,Minneapolis,MN,USA)软件对数据统计,分析复合抑菌剂对年糕中细菌的抑制效果,并换算为抑菌率。

表1 试验因素水平编码表

1.4 检测方法

菌落总数的测定:按国标 GB/T4789.2—2003稀释涂布法;霉菌总数的测定:测定采用目测法,以年糕表面的霉菌菌斑总数计数。

抑菌率 =lg cfu/g细菌

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乳酸链球菌素对年糕中细菌的抑制效果

乳酸链球菌素对年糕中细菌抑制作用的试验效果,见图1。

图 1 不同乳酸链球菌素质量浓度对年糕表面细菌抑制的影响

由图 1可以看出,乳酸链球菌素质量浓度对年糕表面的细菌有较明显的抑制效果,两者呈正相关系,即质量浓度越高抑制效果越好;当乳酸链球菌素质量浓度 >0.2 g/L时,乳酸链球菌素对细菌的抑制作用不明显。

2.1.2 丙酸钙对年糕中霉菌的抑制作用

为提高对年糕的霉菌抑制效果,试验在复合细菌抑制液 (2%壳聚糖,1%乳酸,0.30 g/L乳酸链球菌素)中,加入不同量的丙酸钙,浸涂处理后在 25℃下放置 5 d,观测丙酸钙对年糕的霉菌抑制效果,结果见图2。

图2 不同浓度丙酸钙对霉菌抑制的影响

从图 2可见,随着丙酸钙质量浓度的增加,年糕中的霉斑数有明显的下降,当丙酸钙质量浓度>0.3 g/L时,无霉斑产生。

2.1.3 乳酸对年糕中细菌和真菌的抑制效果

乳酸对对年糕中细菌和真菌的抑制效果,是通过降低 pH和自身结构对微生物生长的影响。pH对年糕中细菌和真菌的抑制作用,见图 3和图 4。

由图 3和图 4可见,pH对微生物的抑制作用明显,另外 pH越低,抑制越明显,当 pH为 2时,37℃贮藏 16 d细菌和真菌菌落总数均 <1×103,但是 pH过低,对年糕的品质会造成影响。

2.2 复合抑菌剂对年糕中细菌抑制作用的影响

2.2.1 试验结果与方差分析

试验对年糕细菌抑制作用的主要因素(壳聚糖、乳酸、乳酸链球菌素)进行响应面试验,应用 de2 sign6.0相应的 CCD设计,对抑菌率数据进行统计,结果见表2。

表2 CCD设计方案及抑菌率的测定值

利用Design Expert软件对表 2中的响应值进行二元回归拟合,确立如下回归方程预测模型:Y=0.57 +0.015A+0.070B+0.12C-0.13AA-0.10BB-0.031CC+0.016AB+0.029AC+0.064BC

对模型进行回归分析,结果见表 3。

表3 回归方程系数及其显著性检验

从表 3结果表明:

1)该抑菌剂回归模型 P值为 0.000 1(P<0.01)表示回归模型指标显著;并且模型的 R2=0.967 9也说明回归模型的拟合程度较好,仅有约 3.3%微生物生长数量不能由该模型解释。从失拟项也可看出,失拟项的 P值为 0.050 8(P>0.05)表明不显著,说明试验模型的失拟度好。

2)回归方程分析:二次项 AA和 BB的 P值均<0.01,具有极高的显著性,说明响应值的变化相对复杂,各个试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系,曲面效应显著。一次项 B和 C的 P值均<0.01,说明乳酸、乳酸链球菌素对抑菌率影响极显著,A项 P>0.05,说明壳聚糖对抑菌率影响不显著。交互项BC的 P<0.01,说明乳酸链球菌素和乳酸的交互影响极显著;交互项 AB和 AC的 P值均 > 0.05,说明壳聚糖与乳酸的交互和壳聚糖与乳酸链球菌素的交互影响不显著。

2.2.2 响应面和等高线分析 (RSA)

根据回归分析结果(表3)作出相应的曲面图,结果见图 5至图7。

图 7 Y=f(B,C)的响应面(A=2.0)

从图 5可见:等高线图为圆形形状,表明乳酸和壳聚糖的交互作用不显著,因为等高线图的形状可以反映出交互作用的强弱,椭圆表示 2个因素作用显著,圆形则相反[8]。

从图 6可见:等高线曲率较小,形状近似椭圆,说明壳聚糖和乳酸链球菌素的相互影响较显著。在乳酸链球菌素含量一定时,抑菌率随着壳聚糖增加而增加,当壳聚糖含量增加到一定程度后,抑菌率反而下降。这是因为乳酸链球菌素抑菌机理与成膜的效果有关,当壳聚糖含量过少时,年糕表面不能完整成膜,这样乳酸链球菌素不能很好地在年糕表面成膜,降低了抑菌的作用;若壳聚糖浓度过大,导致膜厚度的增加,与年糕表面接触的乳酸链球菌素浓度的相对下降,反而降低了抑菌效果。

从图 7可见,等高线曲率较小,形状近似椭圆,说明乳酸和乳酸链球菌素的相互影响较显著。当保鲜液含乳酸为 0.5%(pH5.5),抑菌率曲线变化不大且抑菌效果较差;随着乳酸量的增加,pH随之下降,乳酸链球菌素的抑菌作用也明显增加。当乳酸添加1.3%(pH2.5)时,抑菌效果最好,这与文献报道的乳酸链球菌素效价和最适 pH值之间的关系一致[4]。但乳酸含量过高,会导致抑菌率的下降,这是因为乳酸是有机酸,过高含量的乳酸 pH变化已经不明显,由于试验采用的食品工业用乳酸,其中含有 Ca2+,在高价离子存在的情况下,可能降低乳酸链球菌素的抑菌效果[5]。

2.3 年糕复合抑菌剂

通过对模型方程求导,得到曲面的极值点即响应值抑菌率的最大值为 0.70,对应的壳聚糖为2.22%,乳酸为 1.34%,乳酸链球菌素为 0.30 g/L。结合实际,考虑到乳酸链球菌素成本、壳聚糖成膜处理对生产工艺变化和乳酸对年糕风味的影响,将复合抑菌剂修正为壳聚糖2%,乳酸1%,乳酸链球菌素0.30 g/L,预测抑菌率为 0.65。通过验证性试验结果所得的平均抑菌率 (重复 3次)为 0.60,和理论预测值 0.65比较误差在 7%。

综合分析单因素试验及复合抑菌剂试验,采用壳聚糖 2%,乳酸 1%,乳酸链球菌素 0.30 g/L,丙酸钙 0.3 g/L的复合抑菌剂,用涂膜法处理年糕片,待干后真空包装,于 25℃环境下放置 120 d无变质,菌落总数测定 <1 000 cfu/g,低于年糕行业标准,而对照(25℃环境下放置 10 d)有明显霉斑,该抑菌剂大大延长了年糕的保质期。

3 结论

3.1 单因素试验表明:乳酸链球菌素对年糕中细菌有较好的抑制效果,抑制效果呈正相关系;丙酸钙对年糕中霉菌有较好的抑制作用,当丙酸钙质量浓度>0.3 g/L时,无霉斑产生;乳酸对年糕腐败菌的抑制作用是通过降低 pH对微生物生长的影响,pH越低抑制越明显。

3.2 试验通过中心组合设计 (CCD)并建立回归模型,经验证回归的拟合程度好 (R2=0.967 9)。从模型中看出,乳酸链球菌素和乳酸对年糕保鲜的抑菌作用极为显著,二者的交互影响作用也极为显著,壳聚糖浓度影响抑菌剂成膜的厚薄,从而影响到抑菌效果。

3.3 综合考虑各种因素,得出年糕复合抑菌剂配方为壳聚糖 2%、乳酸 1%、乳酸链球菌素 0.30 g/L、丙酸钙 0.3 g/L。采用该抑菌保鲜液进行涂膜处理年糕,真空包装后于 25℃下放置 120 d无变质,菌落总数测定 <1 000 g/cfu,该技术在生产上有积极的应用价值。

[1]胡庆松,刘青梅,杨性民,等,年糕腐败菌的鉴定和菌系分析[J].食品与生物技术学报,2009,28(4)45-49

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For mulating a Compound Inhibitor against SpoilageMicroorganis ms in Rice Cake

Liu Qingmei1Hu Qingsong1,2Yang Xingming1Yu Zhifang2

(ZhejiangWanliUniversity,Ningbo Key Lab ofAgriculture Product Processing Technology1,Ningbo 315100)
(College of Food Science and Technology,Nanjing AgriculturalUniversity2,Nanjing 210095)

The effects of nisin,calcium propionate,lactic acid and chitosan on the growth of spoilage microor2 ganis ms in rice cake were investigated by the response surface method.A regression modelwas established with cen2 tral composite design.Results:Nisin and lactic acid inhibit the growth of spoilage microorganisms significantly,and there is remarkable interaction effect between nisin and lactic acid.Calcium propionate can decrease the mold growth in rice cake.The inhibition effect of chitosan for spoilage microorganisms is concentration dependent.The formulated optimal compound inhibitor is chitosan 2%,lactic acid 1%,nisin 0.30 g/L,and calcium propionate 0.3 g/L.U2 sing the compound inhibitor,the shelf life of the rice cake with vacuum package extends to 120 d at 25℃,with mi2 croorganis m number<1 000 cfu/g.

rice cake,response surface methodology,bacteriostatic

TS201.1 文献标识码:A 文章编号:1003-0174(2010)09-0097-05

科技部“十一五”国家科技支撑计划(2008BADA0B04)

2009-10-02

刘青梅,女,1960年出生,教授,硕士生导师,农产品贮藏及加工