超临界CO2萃取微生物油脂中ARA工艺条件的优化

李丽娜 于长青

(黑龙江八一农垦大学食品学院,大庆 163319)

超临界CO2萃取微生物油脂中ARA工艺条件的优化

李丽娜 于长青

(黑龙江八一农垦大学食品学院,大庆 163319)

为了提取微生物发酵液中的花生四烯酸,提高微生物油脂中花生四烯酸的含量,采用超临界CO2萃取的方法,利用二次回归正交旋转组合试验方案优化萃取的最佳工艺条件,并采用气相色谱分析花生四烯酸含量。试验得出最佳的工艺条件为:萃取温度 32℃、萃取压力 16 MPa、萃取时间 101 min,以 10%甲醇做夹带剂,花生四烯酸的提取率和纯度分别为 45.7%和 19.34%。通过方差分析和验证实验,数学模型可靠并且拟和较好。

花生四烯酸 超临界 CO2提取 微生物油脂 二次回归正交旋转组合试验

花生四烯酸(Arachidonic acid,ARA或AA)是 5, 8,11,14-二十碳四烯酸,是人体前列腺素合成的重要前体物质,具有益智健脑,提高视敏度,酯化胆固醇,抑制血小板凝集,降低血液黏度,调节血脂和血糖,保护皮肤,抗炎症等功能,已经在保健食品、化妆品、医药等领域得到广泛应用[1]。

由于ARA具有广泛的生物活性,其应用前景十分看好,而且纯度越高,价值就越大。ARA的提取方法很多,如传统的有机溶剂法,脂肪酶法等[2-4]。超临界流体萃取技术是近二十年来发展起来的一项应用面广的实用性高新技术[5]。超临界二氧化碳萃取制取油脂与传统提取法相比具有许多优点[6-7],在较低温度下提取,能稳定地处理对温度敏感的物质;产品不含残留溶剂;通过调节温度和压力,溶剂的溶解度可得到改变,可选择性地分离非挥发物;溶剂回收简单;无毒无害,无环境污染问题,因而使得这一技术在石油、医药、食品、化工等领域有着广泛的应用前景[8]。利用超临界 CO2(SCCO2)萃取装置提取深黄被孢霉 YZ-124发酵液中的ARA并用气相色谱分析其纯度,为ARA的研究开发提供试验科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

深黄被孢霉 YZ-124发酵液:黑龙江八一农垦大学食品学院保存[9];花生四烯酸标准品:Sigma公司;CO2气体:大庆可创试剂有限公司。

超临界 CO2萃取装置:南通市华安超临界萃取有限公司;GC9900型气相色谱仪:上海科创色谱仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 材料的预处理

ARA属于多不饱和脂肪酸,其双键易受环境条件变化而被氧化。目前采用较多的萃取方法是将微生物发酵液烘干,进过有机溶剂对其进行浸提,将提取到的微生物油脂进行 SCCO2试验。在此过程中,微生物油脂与空气接触较多,又经过高温干燥,ARA被氧化的机率较大。为克服此弊端,采用旋转蒸发的方法对发酵液进行浓缩,即可以减少微生物油脂与空气的接触又可以保证在较低的温度下对样品进行浓缩,有效的降低了 ARA被氧化的机率,将1 000 mL发酵液真空浓缩到 200 mL。

1.2.2 萃取参数的选择

等量浓缩后的发酵液,分别采取不同的萃取压力、萃取温度和萃取时间进行 SCCO2单因素试验,以确定最佳萃取压力、萃取温度和萃取时间。

1.2.3 分离器温度的确定

选用常规的方法:分离器Ⅰ的温度比萃取温度高 5℃,分离器Ⅱ的温度比分离器Ⅰ的温度高 5℃。

1.2.4 气相色谱分析花生四烯酸含量

样品的处理方法:取微生物油脂 20 mg溶于 2.5 mL正己烷中,加入 0.1 mL 0.5 mol/L的甲醇钠溶液,室温下轻摇 5 min,然后加入少量的无水 Na2SO4去除水分,静置 1 h后,于 3 000 r/min下离心 3 min,上清液进样。

气相色谱条件[10]:色谱柱为弹性石英毛细管柱FFAP(30 m×0.32 mm×0.5μm);柱初温为 100℃,以 8℃/min升温至 240℃,然后恒温至完成分析;汽化室温度为 250℃;载气流量为 48 mL/min;氢气流量为 42 mL/min;空气流量为 261 mL/min;尾吹流量为34 mL/min;进样量为4μL。测定结果以面积归一法计算ARA的含量。

1.2.5 二次回归正交旋转组合试验

表1 因素水平表

2 结果与讨论

2.1 萃取压力对ARA提取效果的影响

压力是超临界 CO2萃取中一个基本参数,不同的萃取物系,萃取压力各异,油脂是弱极性物质,可在较低压力下萃取,为了确保实验的准备性,对较高压力也进行了试验,结果见图 1。

图1 萃取压力对ARA提取效果的影响

如图 1所示,当压力从 10 MPa上升到 16 MPa时,随着压力的升高,ARA提取率逐渐增大。当压力从 16 MPa上升到 20 MPa时,随着压力的升高,ARA提取率逐渐减小。当压力从 20 MPa上升到 35 MPa时,随着压力的升高,ARA提取率逐渐增大。这是因为超临界流体的密度是压力函数,随着压力的声高,流体密度和介电常数增大,溶解能力增大。图中ARA提取率有两个最高点,分别在 16 MPa和 35 MPa时产生,压力在 16 MPa时,ARA提取率最高为37%,压力在35MPa时,ARA提取率最高为 35%,两个压力对ARA提取率差异不显著,从节能的角度考虑,选择 16 MPa作为二次回归正交旋转组合试验的0水平。

2.2 萃取温度对ARA提取效果的影响

温度是超临界 CO2萃取中的另一个基本参数,温度对ARA提取率的影响,结果如图 2。

图2 萃取温度对ARA提取效果的影响

如图 2所示,当温度由 25℃上升到 32.5℃时,随着温度的升高,ARA提取率逐渐增大。当温度从32.5℃上升到 40℃时,随着温度的升高,ARA提取率逐渐减小。当温度为 32.5℃时,ARA提取率最高为 32.6%。这是因为超临界流体的密度是压力函数,随着压力的升高,流体密度和介电常数增大,溶解能力增大。温度与流体溶解能力的关系比较复杂,温度对溶解度很不一样,一方面随着温度的提高,分子热运动速度增加,相互碰撞的概率提高,CO2溶解能力增加;另一方面温度提高,CO2密度降低,携带物质的能力降低。因此,选择 32.5℃作为二次回归正交旋转组合试验的 0水平。

2.3 萃取时间对ARA提取效果的影响

萃取时间对ARA提取率的影响如图 3所示。

图3 萃取时间对ARA提取效果的影响

由图 3可知,随着时间的延长,ARA提取率逐渐增加,但是时间越长,ARA提取率的提高越不显著,即萃取达到了平衡,再增加萃取时间,ARA提取率也不能显著提高。当萃取时间从 80 min延长到 90 min时,ARA提取率提高了 8.3%,而从 90 min延长到100 min时,ARA提取率只提高了 0.6%,因此,从节能的角度考虑,选择 90 min作为二次回归正交旋转组合试验的 0水平。

2.4 夹带剂对提取效果的影响

夹带剂按照极性可分为极性夹带剂和非极性夹带剂,油脂是非极性到弱极性的物质,分别考察了非极性和极性夹带剂对 ARA提取效果的影响。确定试验条件为:萃取压力 16 MPa、萃取温度 32.5℃和萃取时间为 90 min,分别加入 10%的正己烷、甲醇和乙醇,考察夹带剂对 ARA提取率的影响,结果见表2。

表2 不同夹带剂对ARA提取率的影响

由表 2可以看出,不同的夹带剂对 ARA提取效果影响很大。加入非极性溶剂正己烷,ARA提取率和ARA含量略有增加,但变化不大。而加入极性的乙醇和甲醇,ARA提取率和ARA含量明显增加。其原因是流体 CO2是非极性物质,单纯的 CO2只能萃取极性较低的油脂,而发酵液中的 ARA既分布在低极性的甘油脂中,又分布在中等极性的糖脂和极性的磷脂中,并且在磷脂中的比例大于甘油脂中的比例。因此单纯用 CO2效果并不好,而加入非极性的其他溶剂,效果也不明显,只有加入极性的溶剂不仅可以通过提取出中等极性和极性的油脂而使提取率增加,还可以提高微生物油脂中ARA含量。经过方差分析可以看出,使用甲醇的提取率与使用乙醇的提取率差异显著,因此,选择甲醇做为夹带剂。

2.5 萃取条件优化结果

在上述试验的基础上,采用二次回归正交旋转组合试验方案进一步考察萃取温度、萃取压力和萃取时间三个因素对萃取效果的影响,结果见表 3。

以 SAS System 8.2为辅助设计手段,利用试结果和二次回归旋转组合设计统计方法分析进行编程,并对结果进行分析得回归方程如下:

表 3 二次回归正交旋转组合试验结果

方程中 Y为花生四烯酸提取率,X1为萃取温度,X2为萃取压力,X3为萃取时间。回归方程各项的方差分析及回归方程的方差分析见表 4。

表4 回归方程的方差分析表

对数学模型的方差分析说明二次回归模型的 F值为 25.39,P值 <0.000 1,大于在 0.01水平上的 F值,而失拟项的 F值为 0.28,小于在 0.05水平的 F值,说明该模型拟合良好。一次项和二次项的 F值均大于 0.01水平上的 F值,说明各因素对萃取具有极其显著的影响,各因素影响程度从大到小的依次顺序为萃取温度、萃取压力和萃取时间。由回归模型得出萃取的最佳条件为:萃取温度 32℃、萃取压力 16.4 MPa和萃取时间 101.5 min,ARA提取率最大为 46.35%。根据此条件进行验证,试验条件为:萃取温度 32℃、萃取压力 16 MPa和萃取时间 101 min,ARA提取率为 45.7%,与预测值相差 3.7%,且重复试验相对偏差不超过 2%,说明提取条件重现性良好。

2.6 响应面分析

为了观察某两个因素同时对花生四烯酸提取率的影响,采用降维的分析方法,即固定其中一个因素为 0水平(即编码水平为 Xi=0),则可得到另外两个因素与花生四烯酸提取率的关系。而令某一因素水平值为零,就得到某两个因素对花生四烯酸提取率影响的二元二次方程。因此,下面将对这些因素中交互相之间的交互效应进行分析[11]。

2.6.1 萃取温度和萃取压力的交互效用分析

令萃取时间等于零,得到萃取温度和萃取压力交互效应的二元二次方程,即为:

根据方程 (2)采用 SAS System 8.2统计软件绘制萃取温度和萃取压力对花生四烯酸提取率的响应面曲图和等高线图,如图 4所示。

图 4 花生四烯酸提取率与萃取温度、萃取压力的响应面图及等高线图

由图 4中的响应面曲线以及等高线的疏密程度可知,萃取温度在[27.5℃,32.5℃]范围内,萃取压力在[12 MPa,16 MPa]范围内,两者存在着显著的增效作用,花生四烯酸提取率随着萃取温度和萃取压力的增加而升高;当萃取温度达到 32.5℃、萃取压力达到 16 MPa时,两者的协同作用达到最大,花生四烯酸提取率最高;而当萃取温度在[32.5℃,37.5℃]范围内,萃取压力在[16 MPa,20 MPa]范围内,花生四烯酸提取率反而随着两个因素的增加开始下降,说明此时两者存在着明显的拮抗作用。

2.6.2 萃取温度和萃取时间的交互效用分析

令萃取压力等于零,得到萃取温度和萃取时间交互效应的二元二次方程,即为:

根据方程(3)采用 SAS System 8.2统计软件绘制萃取温度和萃取时间对花生四烯酸提取率的响应面曲图和等高线图,如图 5所示。

图 5 花生四烯酸提取率与萃取温度、萃取时间的响应面图及等高线图

由图 5中的响应面曲线以及等高线的疏密程度可知,萃取温度在[27.5℃,32.5℃]范围内,萃取时间在[70 min,90 min]范围内,两者存在着显著的增效作用,花生四烯酸提取率随着萃取温度和萃取时间的增加而升高;当萃取温度达到 32.5℃、萃取时间达到 90 min时,两者的协同作用达到最大,花生四烯酸提取率最高;而当萃取温度在 [32.5℃,37.5℃]范围内,萃取时间在[90 min,110 min]范围内,花生四烯酸提取率反而随着两个因素的增加开始下降,说明此时两者存在着明显的拮抗作用。

2.6.3 萃取压力和萃取时间的交互效用分析

令萃取温度等于零,得到萃取压力和萃取时间交互效应的二元二次方程,即为:

根据此回归方程采用 SAS System 8.2统计软件绘制萃取压力和萃取时间对花生四烯酸提取率的响应面曲图和等高线图,如图 6所示。

图 6 花生四烯酸提取率与萃取压力、萃取时间的响应面图及等高线图

由图 6中的响应面曲线以及等高线的疏密程度可知,萃取压力在[12 MPa,16 MPa]范围内,萃取时间在[70 min,90 min]范围内,两者存在着显著的增效作用,花生四烯酸提取率随着萃取压力和萃取时间的增加而升高;当萃取压力达到 16 MPa、萃取时间达到 90 min时,两者的协同作用达到最大,花生四烯酸提取率最高;而当萃取压力在[16 MPa,20 MPa]范围内,萃取时间在[90 min,110 min]范围内,花生四烯酸提取率反而随着两个因素的增加开始下降,说明此时两者存在着明显的拮抗作用。

2.7 气相色谱分析结果

本研究所采用的毛细管气相色谱程序升温条件,可以将饱和与不饱和长链脂肪酸甲酯分开。检测出的脂肪酸结果如图 7。

图7 微生物油脂气相色谱分析结果

结果表明,高产菌株 YZ-124的发酵液经过CO2超临界萃取获得的微生物油脂中ARA的保留时间为 17.918 min,ARA的质量分数为 29.34%,另外还含有丰富的其他多不饱和脂肪酸,组分及其含量如表5。

表5 微生物油脂的脂肪酸组分

3 结论

通过采用二次回归正交旋转组合试验方案对超临界CO2萃取ARA的条件进行了优化,得出最佳萃取条件为萃取温度 32℃、萃取压力 16 MPa、萃取时间 101 min和 10%甲醇。通过 SAS8.2软件对试验数据进行分析,得出的回归模型显,并且该模型拟合良好。按照试验得出的最佳萃取条件进行试验, ARA提取率为 45.7%,ARA质量分数为 19.34%。超临界流体萃取只能分离碳链长度差别较大脂肪酸,不能将碳链长度相接近脂肪酸分开,为了进一步提高微生物油脂中的ARA含量,应需结合别的分离技术,如分子蒸馏法、尿素包合法、高效液项制备色谱法等。

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Opti mizing Supercritical CO2Extraction ofArachidonic Acid from MicrobialOil

LiLina Yu Changqing

(Foodstuff College,Heilongjiang August FirstLand Reclamation University,Daqing 163319)

Supercritical CO2fluid technologywas used to extract arachidonic acid(ARA)from microbial oil.An orthogonal rotatable central composite design was employed to deter mine the optimum conditions for the extraction,u2 sing GC tomeasure ARA Content.Results:The deter mined optimum extraction conditions are temperature 32℃,pres2 sure 16MPa,time 101 min and using 10%methanol as entrainer.The extraction rate is 45.7%and product purity is 19.34%.Variance analvsis and verification test show that the mathematicalmodel isreliable and fits fine.

arachidonic acid,supercritical CO2fluid,extract,microbial oil,orthogonal rotatable central compos2 ite design

TS224.4 文献标识码:A 文章编号:1003-0174(2010)03-0059-06

大庆市科技局科技项目(SGG2009-010)

2009-03-30

李丽娜,女,1981年出生,硕士,食品科学

于长青,男,1969年出生,教授,硕士生导师,畜产品加工和功能性食品研究与开发