反相高效液相色谱法测定甘油二酯含量研究

汪 勇宋坷珂王丽丽韩 雪赵谋明

(华南理工大学轻工与食品学院1,广州 510641)

(暨南大学食品科学与工程系2,广州 510632)

反相高效液相色谱法测定甘油二酯含量研究

汪 勇1,2宋坷珂2王丽丽2韩 雪2赵谋明1

(华南理工大学轻工与食品学院1,广州 510641)

(暨南大学食品科学与工程系2,广州 510632)

用分子蒸馏和柱层析的方法制备了大豆油甘油二酯 (DAG)的标准样品,通过高效液相 -电喷雾质谱联用(HPLC-ESI-MS)和薄层色谱法 (TLC)验证了标准样品的纯度。用反相高效液相色谱 (RPHPLC)在UV=210 nm做大豆油DAG的标准曲线,在质量浓度范围 1.0～12.0 mg/mL,大豆油DAG标准曲线线性良好。通过加样回收试验表明,加样回收率在 104%～109%之间,RSD在 0.69%～5.19%之间。并用该方法分析了大豆油、分子蒸馏DAG样品中的DAG。

甘油二酯 反相高效液相色谱 分子蒸馏

甘油二酯 (diacylglycerol,DAG)是一种新兴的保健油脂。由于甘油二酯和食用油中的主要成分三酰甘油有截然不同的代谢途径,食用甘油二酯可以降低餐后血脂水平从而防止和控制肥胖[1]。1999年,花王公司首先在日本市场推广DAG油,DAG烹调油在日本市场称为“Econa健康烹调油”,在美国称为“Enova oil”,由花王公司和美国 ADM公司合资生产[2]。

甘油二酯(DAG)的分析可以用薄层色谱法(thin layer chromatography,TLC)[3-5]、高效液相色谱法 (high perfor mance liquied chromatography,HPLC)[6-7]和气相色谱法 (gas chromatography,GC)等[8-10]。TLC法的缺点是精度不高,GC需要专门的高温气相色谱通过程序升温到接近 380℃,由于采用程序升温,基线漂移较大。HPLC是一种高效、准确的分析方法,色谱柱主要有正相柱 (normal phase,NP)和反相柱 (re2 versed phase,RP)两种。RP-HPLC在油脂分析中使用更加普遍,因为油脂的极性相对较小,使用反相柱可以获得比正相柱更好的分离效果。前期采用磷脂酶A1催化水解大豆油制备富含甘油二酯的油脂,主要采用高效液相色谱折光指数 (R I)检测器分析样品中甘油二酯的相对含量[11-12],这种方法虽然操作方便,但是无法测定DAG的绝对含量。

利用二极管阵列 (PDA)检测器对原料和酶水解产品的甘油二酯组成种类和含量进行了分析和比较。通过自制甘油二酯(DAG)标准样品,建立DAG的标准曲线,达到快速准确分析和检测 DAG的目的。同时通过液相色谱/电喷雾质谱 (HPLC/ESI/ MS)联用鉴定水解产物和原料中的甘油酯成分。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆油:张家港东海粮油工业有限公司;磷脂酶A1(Lecitase Ultra)(酶活力 10 000 U/g):丹麦诺维信公司;SI L GF254硅胶板:青岛海洋化工有限公司。

LC20-AT液相色谱系统:日本岛津仪器有限公司;4000 Q TRAP型液相质谱联用仪:美国应用生物技术有限公司;MD-80型分子蒸馏设备:广州汉维有限公司。

1.2 甘油二酯标准样品的制备

甘油二酯标准样品通过分子蒸馏和柱层析制备,方法如下:50.00 g大豆油加酶量 30 U/g,温度45℃,加水量 40%,经过磷脂酶A1催化下水解8 h。反应后静置分层 60 min,上层为水解油层。油层在160℃分子蒸馏脱酸,收集重相。重相在 215℃分子蒸馏,收集轻相甘油二酯油 (Diacylglycerol oil,DO),取 1.00 gDO溶解在 20 mL的正己烷中,然后溶液上硅胶柱 (<1.5 cm×30 cm)。DO中的三酰甘油(TAG)用250 mL的正己烷洗脱除去,DAG用400 mL的乙醚/正己烷 (3∶7,体积比)洗脱收集。DAG标准样品用旋转蒸发真空下脱溶剂,得到 DAG标准样品。标准样品的纯度通过薄层色谱(TLC)和 HPLC/ ESI/MS鉴定纯度。TLC展开剂为苯/乙醚/乙酸乙酯/乙酸 (80∶10∶10∶0.2,体积比)。通过碘蒸气显色。

1.3 大豆油甘油二酯的制备

通过磷脂酶A1催化水解,一次分子蒸馏制得富含甘油二酯大豆油,二次分子蒸馏制得大豆油DAG[12]。

1.4 原料及产品的 HPLC/ESI/MS分析

将大豆油、分子蒸馏产品和标准样品配成 1.0 mg/L的样品,进液质联用仪,测定各组分的分子离子峰。HPLC条件为:流动相(乙腈/异丙醇/甲酸,550∶450∶0.5),流速 0.2 mL/min,柱温:40℃,色谱柱:Pin2 nacle IIC18 5μm(150×2.1 mm i.d.)(美国 Restek公司),质谱条件为:电喷雾 (ESI)离子源,正离子模式,m/z∶300～1 200,离子扫描速率为 5 500 amu/s。

1.5 HPLC分析甘油二酯

1.5.1 标准曲线

将标准样品配成 10.0、5.0、3.3、2.5、1.25 mg/mL的标准液,用 HPLC在 PDA(UV=210 nm)检测器中分析产品组成。色谱条件为:流动相 (乙腈/异丙醇,56∶44),流速 1.0 mL/min,柱温 40℃,色谱柱为Diamonsil C18(5μm 150×4.6mm,天津迪马科技有限公司)。选取 PP、OO+PO、LO、LL和LLn(P,棕榈酸;L,亚油酸;Ln,亚麻酸;O,油酸。)5个甘油二酯峰作为特征峰,以浓度为横坐标,以 DAG特征峰面积之和为纵坐标做标准曲线。

原料和DAG样品配成 10.0～20.0 mg/mL的样品溶液,用HPLC在 PDA(UV=210 nm)检测器中分析产品组成,选取 PP、OO+PO、LO、LL和LLn 5个甘油二酯峰作为特征峰计算峰面积之和,通过标准曲线计算样品中甘油二酯的含量。

1.5.2 加样回收

表1 加样回收样品中标准物质的添加量

将大豆油原料配成 22.0 mg/mL的样品液 (A),取样品液和标准液 10.86 mg/mL(B),按表 1配成待测定样品。测定各样品的DAG质量浓度,并计算加样回收率。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线和加样回收

大豆油DAG标准样品的 HPLC(UV=210 nm)图谱见图 1。可以看出,标准样品中都是DAG的峰。通过 TLC分离,再经过碘蒸汽显色 (图 2)可以看见只有DAG的点。另外经过 HPLC/ESI/MS检测在标准样品中没有发现单甘酯(MAG)和 TAG的分子离子峰,从而证明了标准样品的纯度很高。

图1 大豆油DAG标准样品的HPLC图谱

由于大豆油的 DAG是混合物,其中还包括DAG的异构体,所以不可能商业化地购买所有的DAG的标准样品用来确定每一种DAG的含量。而且由于各种植物油的DAG的种类和比例有自身的特点,所以最好的 DAG标准样品应该是从原料本身制备出来的,因为这种制备的标准样品和样品中的DAG的种类一致,可以很好的反映样品中DAG的组成。由于不同 DAG在紫外的相应系数不同,所以这种从原料中制备的标准 DAG样品,远比一两个商业化的 DAG标样更具有代表性,而且测定更加准确。

图2 标准DAG样品和大豆油的 TLC图谱

通过 HPLC/ESI/MS按照出峰时间以及分子离子峰的质荷比数值可以准确有效的分析原料及水解产品中各种甘油酯的成分。电喷雾离子化 (ESI)是一种温和的离子化技术,这种技术只产生物质的分子离子峰,而不会像电子轰击质谱那样的得到过多的碎片峰,非常适合物质分子量的测定[13]。但是ESI技术一般会产生分子和 Na+和 K+的复合离子峰,原因是在样品中或者样品池中含有微量的 Na+和 K+,这个复合离子在质谱中的响应值远比分子的[M+H]+高,一些研究也提到了在 ESI质谱图中出现脂质的 Na+和 K+的复合离子峰[14-16]。大豆油和大豆油DAG产品部分典型TAG和DAG的质谱图见图3。

图3 大豆油和大豆油DAG中的典型 TAG和DAG的钠和钾结合分子离子[M+Na]+和[M+K]+

大豆油DAG标准曲线见图4,在质量浓度 1.0～12.0 mg/mL范围具有很好的线性关系。

图4 大豆油DAG的HPLC标准曲线

加样回收数据见表 2,可以看出,DAG标准样品加样回收率在 104%～109%之间,RSD在0.69%～5.19%之间,证明采用制备的DAG标准样品测定样品中的DAG含量方法准确可靠。

表2 大豆油DAG标准样品加样回收

2.2 大豆油DAG样品中DAG含量的测定

通过 RP-HPLC法测定大豆油、酶催化水解液、富含DAG大豆油和大豆油DAG的DAG含量见表3,色谱图见图 5,通过分子蒸馏可以很好的去除磷脂酶A1水解大豆油释放出的脂肪酸以及纯化甘油二酯。用RP-HPLC标准曲线法可以很好的测定磷脂酶A1催化水解大豆油,以及分子蒸馏制备甘油二酯产品的DAG含量。

表3 HPLC法测定的不同原料的DAG含量

图5 大豆油DAG油脂的RP-HPLC图谱

3 结论

采用分子蒸馏和柱层析的方法制备了大豆油DAG的标准样品,通过 HPLC/ESI/MS和 TLC分析该标准样品中无MAG和 TAG组分,DAG纯度高。通过标准曲线和加样回收试验证明,在质量浓度范围 1.0～12.0 mg/mL,大豆油DAG标准曲线线性良好,加样回收率在104%～109%之间,RSD在0.69%～5.19%之间。采用DAG标准样品分析原料和产物中DAG的含量的方法准确可靠。

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Deter mination ofDiacylglycerol Content by Reversed Phase High Perfor mance Liquid Chromatography

Wang Yong1,2Song Keke2Wang Lili2Han Xue2Zhao Mouming1

(College ofLight industry and Food Science,South China University of Technology1,Guangzhou 510641)
(Department of Food Science and Engineering,Jinan University2,Guangzhou 510632)

Soybean diacylglycerols(DAG)reference materialwas prepared by combination of molecular distil2 lation and column chromatography.The purity of the reference materialwas verified by high performance liquid chro2 matography/electrospray ionization/mass spectrometry and thin layer chromatography.Results:The calibration curve of soybean DAG built by reversed phase-HPLC at UV=210 nm shows a good linear at concentrations in range of 1.0～12.0 mg/mL.Recovery experiments show the recoveries of samples are in range of 104%～109%with RSD in range of 0.69%～5.19%.The contents ofDAG in soybean oil and its related DAG samples produced by molecular distillation were analyzed by thismethod.

diacylglycerol,reversed phase-HPLC,molecular distillation

TS227 文献标识码:A 文章编号:1003-0174(2010)03-0119-05

广东省科技攻关重点项目(2008A01090003)

2009-04-11

汪勇,男,1977年出生,讲师,博士,粮食、油脂及植物蛋白工程

赵谋明,男,1964年出生,男,教授,博士生导师,食品科学