裙带菜酸性多糖的分离纯化与鉴定*

钱垂文，张志东，王一飞

1(暨南大学生物医药研究开发基地，广东 广州，510632) 2(暨南大学第一附属医院，广东广州，510632)

裙带菜酸性多糖的分离纯化与鉴定*

钱垂文1，张志东2，王一飞1

1(暨南大学生物医药研究开发基地，广东 广州，510632) 2(暨南大学第一附属医院，广东广州，510632)

利用水煮法及乙醇分级沉淀获得裙带菜粗多糖(UPPS-2)，粗多糖经DEAE离子交换层析获得2个纯化组分(UPPS-2.1、UPPS-2.2)。对UPPS-2.1、UPPS-2.2样品进行了系列的理化特性鉴定(包括分子质量、糖含量、蛋白含量、硫酸基含量、葡萄糖醛酸含量、单糖组成及含量、糖苷键构型等)。试验结果表明:UPPS-2.1、UPPS-2.2的相对分子质量分别为1.5×105、9.4×104;糖含量分别为27.49%、31.06%;蛋白含量分别为0.00%、1.14%;硫酸基含量分别为16.90%、26.33%;二者的单糖组成相同(包括海藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和甘露糖)，但组成单糖的含量差异较大，前者以岩藻糖(85.78%为主，而后者主要以岩藻糖(35.93%)和甘露糖(55.76%)为主;红外光谱测定结果表明，二者均具有多糖特征吸收峰，糖苷键构型主要为β-糖苷键。经纯化后获得多糖组分UPPS-2.1是以β-糖苷键连接的主要由岩藻聚糖为主的杂多糖硫酸酯，而UPPS-2.1则是以β-糖苷键连接的主要由岩藻糖和甘露糖组成的杂多糖硫酸酯。

裙带菜，多糖，纯化，鉴定

裙带菜(Undaria pinnatifida(Harv.)Suringar)属褐藻门裙带菜属，是一种温带性多年生大型褐藻，主要分布在日本、朝鲜半岛和我国大连、青岛沿海。我国产裙带菜主要作为食材出口到日本，年产值约10亿元。由于出口国单一，国内消费市场尚未形成，产品不能进行深加工，附加值低，价格逐年下降。

裙带菜营养丰富，被誉为“天然海洋蔬菜之首”，具有重要的营养价值和保健功能，同时在药物研发方面也显示出潜在的开发前景［1－3］。裙带菜中含有多种营养成分，据初步分析100 g干品中含粗蛋白11.6 g，脂肪 0.32 g，糖类 37.81 g，灰分 18.93 g，还含有多种维生素，其中糖类是裙带菜中重要组成成分。目前国内外对裙带菜多糖的提取工艺研究报道较多，由于多糖成分、结构复杂，对其理化性质深入研究的很少。本文利用现代先进仪器设备及经典检测方法对裙带菜多糖的理化性质作了一个较为全面的研究。

1 材料和方法

1.1 实验材料与试剂

新鲜裙带菜，产自大连海域(5月份)。

DEAE-Cellulose 52离子交换树脂(Whatman公司进口分装)，标准单糖、苯酚、三氟乙酸、咔唑、硫酸铜、酒石酸钠等试剂，均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 裙带菜多糖的分离纯化［4］

1.2.1.1 裙带菜多糖的初步纯化

用自来水将裙带菜洗净→蒸馏水洗2次→50℃烘干→粉碎→加热浸提(搅拌)→离心取清液→加热浓缩(原体积的1/8)→乙醇沉淀(含醇量达75%)→4℃静置12 h→离心取沉淀→50℃干燥→粗多糖干品(UPPS-0)→将粗多糖加水复溶→加入乙醇至醇含量达20%→4℃静置12 h→离心→沉淀依次用丙酮、乙醚、无水乙醇洗涤，50℃干燥得褐藻胶(UPPS-1)→上清继续加入乙醇至醇含量达60%→4℃静置12 h→离心→沉淀依次用丙酮、乙醚、无水乙醇洗涤，50℃干燥得裙带菜多糖初品(UPPS-2)

1.2.1.2 裙带菜多糖的精纯(DEAE离子交换层析)

装柱:将活化后的DEAE-cellulose 52离子交换填料装填柱型为26cm×20cm层析柱(柱床高度为15cm)。

平衡:用20mmol/L的 Tris-HCl液以2.5mL/min流速平衡柱床3个柱床体积。

上样:称取UPPS-2(多糖初品)100 mg用15mL 20mmol/L的Tris-HCl溶液溶解，以1mL/min流速上样。

洗脱:依次用 20mmol/L的 Tris-HCl液及用20mmol/L 的 Tris-HCl溶液配成的含 0.1、0.3、0.5、1.0mol/L NaCl溶液洗脱。

收集:用Waters自动收集仪收集，每管10mL，每组收30管。收集液用苯酚-硫酸显色法跟踪检测多糖，在波长为490nm处测定吸光度，绘制洗脱曲线，同一吸收峰内的洗脱液合并，真空旋转蒸发浓缩，蒸馏水透析2天，冷冻干燥，得到裙带菜多糖的精纯产物。

1.2.2 裙带菜多糖的鉴定

1.2.2.1 多糖相对分子量的测定［5］

1.2.2.2 多糖样品中总糖含量测定［6］

1.2.2.3 多糖的样品中蛋白质含量的测定(Lowry法)［7］

选用核酸蛋白测定仪(美国Beckman公司)。

1.2.2.4 多糖紫外光谱分析［8］

所用紫外分光光度计为日本岛津公司UV-1700型。

1.2.2.5 多糖样品中总硫酸基含量的测定［9］

1.2.2.6 多糖样品中葡萄糖醛酸含量的测定——硫酸-咔唑法［10］

1.2.2.7 裙带菜多糖的单糖组成

(1)利用高效离子色谱分析单糖组分［11－12］。离子色谱仪(美国戴安公司TCS-2500型)，色谱条件:分离柱采用Dionex公司Carbo PacTMPA10预处理柱、Carbo PacTMPA10(2.0 mm×250 mm)检测柱;脉冲安培检测器工作参数:E1为100 mV，400 ms;E2为－2 000 mV，20 ms;E3为600 mV，10 ms;E4为－100 mV，70 ms。流动相:采用浓度为20 mmol/L的NaOH作淋洗液;淋洗方法采用单一浓度淋洗。流速:0.25mL/min;上样量:25μL;温度 30℃。

(2)薄层色谱(TLC)分析［13］。

1.2.2.8 裙带菜多糖的结构分析

(1)红外光谱测定多糖的糖苷键构型［14］。取裙带菜多糖样品各2 mg，与100～200 mg KBr混合于玛瑙研钵中研细，压片，在红外光谱仪(德国BRUKER EQUINOX55型)上作全波段(4 000～400cm－1)扫描。

(2)比旋光度法［15］。分别称取多糖各10 mg，蒸馏水溶解并定容至25mL，T=20℃，以数显自动旋光仪型(上海WZZ-2A型)测定多糖旋光度，以蒸馏水为空白。

2 结果与讨论

2.1 裙带菜多糖的纯化结果

裙带菜多糖UPPS-2经DEAE-Cellulose52离子交换柱层析，洗脱曲线如图1。

图1 多糖UPPS-2在DEAE-52层析柱上的洗脱曲线

通过苯酚-硫酸法检测显示在第76、102管(即380、510 min)分别出现吸收峰值，对应洗脱条件为0.3、0.5mol/L NaCl溶液。分别合并72～82管，99～107管，得到UPPS-2.1、UPPS-2.2两个组分，经冻干后，UPPS-2.1为白色纤维状，质量43.7 mg;UPPS-2.2为浅黄色纤维状，质量9.8 mg，离子交换层析的产率分别为43.7%及9.8%。

2.2 裙带菜多糖的鉴定结果

2.2.1 裙带菜多糖的理性特性

UPPS-2及UPPS-2.1、UPPS-2.2纯化组分的部分理化特性多糖结果见表1。

表1 裙带菜多糖鉴定(部分)结果

2.2.2 多糖的紫外吸收光谱图

由图2～图4可见，3种多糖的紫外吸收图谱与Lowry法所测蛋白质含量的结果一致。

2.2.3 裙带菜多糖的单糖组成

2.2.3.1 离子色谱分析

保留时间(min):1，海藻糖(Fuc)4.87;2，鼠李糖(Rha)8.08;3，阿拉伯糖(Ara)9.08;4，半乳糖(Gal)11.40;5，葡萄糖(Glu)12.52;6，甘露糖(Man)/木糖(Xyl)14.30。

图2 UPPS-2的紫外光谱图

图3 UPPS-2.1的紫外光谱图

图4 UPPS-2.2的紫外光谱图

图5 各标准单糖的离子色谱图

图6 UPPS-2.1的离子色谱图

图7 UPPS-2.2的离子色谱图

将裙带菜多糖UPPS-2.1/UPPS-2.2的单糖组成高效粒子色谱图与标准单糖的高效离子色谱图进行比对确定其单糖组成，同时对各峰面积进行定量计算确定各单糖组成的相对含量，结果见表2。

表2 纯化样品 UPPS-2.1、UPPS-2.2中单糖的组成及相对百分比

2.2.3.2 薄层色谱(TLC)分析

对UPPS-2.1和UPPS-2.2进行薄层层析分析其单糖组成，结果如图8所示。

根据UPPS-2.1和UPPS-2.2的Rf值推断其单糖组成结果与离子色谱结果基本一致，唯一不同的是2种多糖均检出葡萄糖醛酸，而在离子色谱中未检出，推测可能因为葡萄糖醛酸的洗脱时间太短，离子色谱未能检出。

2.2.4 裙带菜多糖的结构分析

2.2.4.1 红外光谱测定多糖的糖苷键构型［16－17］

UPPS-2.1、UPPS-2.2红外吸收光谱经查标准图谱［19］得各多糖红外光谱解析结果，具体结果见表3。

图8 UPPS-2.1、UPPS-2.2的薄层色谱图

表3 UPPS-2.1、UPPS-2.2红外吸收光谱解析

由表3中可以看出，UPPS-2.1、UPPS-2.2均含有多糖的特征吸收峰，其中3 600～3 200cm－1和1 400～1 200cm－1的2组特征吸收峰是判断多糖的依据;810cm－1附近为甘露糖的特征吸收峰，它的位置与硫酸根在糖上的连接位置有关，吸收峰位于817.76cm－1及 817.67cm－1说明 UPPS-2.1、UPPS-2.2 的硫酸根连接在岩藻糖的 C2或 C3位;UPPS-2.2在1 243.53cm－1处有较强的吸收峰，表明其硫酸基含量较高。综合上述结果，可见二种多糖均为岩藻甘露吡喃聚糖，主要由β-糖苷键组成。

2.2.4.2 比旋光度法

裙带菜多糖UPPS-2.1的比旋光度［α］为－75，UPPS-2.2的比旋光度［α］为－37.5。由于UPPS-2.1与UPPS-2.2的比旋光度都为较大的负值，可以判定它们都是主要以β-糖苷键连接的，这与红外光谱测定的结果相一致。

由于多糖结构的复杂性(特别是空间结构的复杂性)，限于目前的研究手段和方法，还无法对其结构做出精确的解析。本课题的研究，为裙带菜多糖的综合开发打下良好的实验基础。

3 结论

经分离纯化获得两种多糖中，UPPS-2.1产率较高，相对分子质量为1.5×105，经组成与结构分析，确定其是以β-糖苷键连接的主要由岩藻聚糖为主的杂多糖硫酸酯;而UPPS-2.2产率相对较低(9.8%)，相对分子量为9.4×104，组成与结构和UPPS-2.1基本相同，是主要由岩藻糖和甘露糖组成的杂多糖硫酸酯，多糖的硫酸基连接在岩藻糖的C2或C3位上。

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Purification and Identification of Acid Polysaccharide from Undaria pinnatifida

Qian Chui-wen1，Zhang Zhi-dong2，Wang Yi-fei1
1(Jinan Biomedicine Research and Development Center，Jinan University，Guangzhou 510632，China)2(The First Affiliated Hospital，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

To isolate and identify the acid polysaccharides from Undraria pinnatifida.Methods:Crude polysaccharides were extracted by alcohol grade precipitation from boiled Undraria pinnatifida solvent，then the crude polysaccharides were seperated by DEAE-Cellulose 52 chromatography.Two fractions obtained after elution were named UPPS-2.1 and UPPS-2.2.The physicochemical properties of UPPS-2.1 and UPPS-2.2 were studied including molecular weight，percentage of total sugar，protein，sulfate，and composition of monosaccharides，patterns of glucosidic bond.Results:The molecular weight of UPPS-2.1 and UPPS-2.2 was 1.5 ×105，9.4 ×104respectively，the percentage of total sugar was 27.49%，31.06%，the percentage of protein was 0.00%，1.14%，the percentage of sulfate wa 16.90%，26.33%in UPPS-2.1 and UPPS-2.2 respectively.Monosaccharide composition of UPPS-2.1 and UPPS-2.2 was same，but the percentage of monosaccharides was different by ion chromatography.The purified polysaccharides is mainly composed of β-glucosidic bonds.The main monosackcharide of the UPPS-2.1 was Fuc(85.78%)，whereas in UPPS-2.2 were Fuc(35.93%)and Man/Xyl(55.76%).The SO42－of polysaccharides is link up with C2 or C3 in Fuc.Conclusion:The UPPS-2.1 was mainly composed of Fuc sulfate heterosaccharides linked by β-glucosidic bond.Whereas the UPPS-2.2 was mainly composed of Fuc and Man/Xyl sulfate heterosaccharides linked by β-glucosidic bond.

Undaria pinnatifida，polysaccharide，purification，identification

博士研究生，助理研究员(王一飞教授为通讯作者E-mail:twangyf@jnu.edu.cn)。

*国家自然科学基金广东联合基金(U0632010);广州市天河区科技计划项目(072G111)基金资助

2010－03－10，改回日期:2010－10－28