生物法生产3-羟基丁酮的研究概况

徐慧，贾士儒，刘建军

1(天津科技大学天津市工业微生物重点实验室，天津，300457)2(山东省食品发酵工程重点实验室，山东济南，250013)

生物法生产3-羟基丁酮的研究概况

徐慧1，贾士儒1，刘建军2

1(天津科技大学天津市工业微生物重点实验室，天津，300457)2(山东省食品发酵工程重点实验室，山东济南，250013)

3-羟基丁酮是一种重要的风味物质和平台化合物，在食品、化工、医药等行业具有广泛的用途，目前主要以化学合成方法生产。3-羟基丁酮是许多微生物糖代谢的中间产物，以淀粉质原料，生物法生产3-羟基丁酮技术的研究已引起人们的广泛关注，本文综述了生物法生产3-羟基丁酮的研究概况，主要包括3-羟基丁酮生产菌株、代谢机理及相关酶类、代谢调节机制及高效积累策略等。

3-羟基丁酮，菌株，发酵，生产

3-羟基丁酮，又名乙偶姻、甲基乙酰甲醇，自然存在于玉米、葡萄、可可、苹果、香蕉、干酪、肉类等许多食品中，是一种应用广泛、令人喜爱的食用香料，具有令人愉快的奶油香味，是国际上常用的香料品种，主要用作奶油、乳品、酸奶和草莓型等香料的生产，与啤酒、葡萄糖的风味有关，并且对黄油及奶油发酵制备奶酪过程中香味的产生起关键作用，我国标准GB2760－86规定其为允许使用的食品香料，美国食品和萃取协会(FEMA)安全号为2008，其推荐用量如表1。

表1 3-羟基丁酮的推荐用量［1］

3-羟基丁酮在食品、化工、医药等行业具有广泛的用途，此外，2004年美国能源部将3-羟基丁酮列为30种优先开发利用的平台化合物之一，目前主要以化学合成方法生产，开展环境友好、产品可视为纯天然的生物法生产3-羟基丁酮的技术研究已引起人们的高度关注［2］。国内外以化学合成法生产3-羟基丁酮主要采用以丁二酮部分加氢还原工艺、2，3-丁二醇选择性氧化工艺和丁酮氯化水解工艺为主，这3种工艺都普遍存在产品收率和得率较低，环境污染较严重等缺点，且产品的质量安全受到质疑。化学合成工艺使用的原料，如丁二酮、2，3-丁二醇等主要是来源于不可再生的化石资源，且这些原料本身也是比较重要的化工产品，石油资源的日益短缺以及石油价格的日益攀升，原料来源受到限制，产品成本将越来越高，已成为限制化学合成法生产3-羟基丁酮大规模发展的主要瓶颈。3-羟基丁酮分子中含有不对称碳原子，具有2种手性异构体，而目前还不能合成光学纯度高以及旋光度一定的产品，采用常规的物理方法(例如分馏、分步结晶等)进行手性拆分是非常困难的，这也限制了化学合成法生产3-羟基丁酮的发展和应用。

随着生物技术的发展，生物技术在风味物质合成中发挥着越来越重要的作用，化学品或石油化学品合成风味物质逐步被酶法合成或发酵技术生产所代替。众所周知，生物过程环境友好，此外，许多国家的食品法规已认可天然风物剂可以由生物技术获得，具有商业价值的天然化合物生物生产技术的研究开发已引起人们的高度关注。近年来关于生物法生产3-羟基丁酮的技术研究已有许多报道，尽管多数研究尚处于实验室研究阶段或小批量生产阶段，仍存在诸多技术或经济性问题，但生物工艺环境友好、产品安全以及原料可以再生等优势必将成为未来3-羟基丁酮生产的主导方向。

1 酶转化法生产3-羟基丁酮

酶转化技术代替传统的化工工艺已有很多成功的例子，该工艺方法的关键是要获得大量特异性的酶。1992年美国的 Hummel［2］等应用乳酸杆菌或酵母菌菌体中的丁二酮还原酶(双乙酰还原酶)作为生物催化剂催化丁二酮还原生成3-羟基丁酮。该方法首先是通过培养乳酸杆菌或酵母菌，分离纯化获得菌体细胞内的丁二酮还原酶，在pH5.0、温度70℃下，由得到的丁二酮还原酶及辅酶NAPH催化还原丁二酮生成3-羟基丁酮，该方法的优点是产率最高达100%，且没有其它副产物产生，由于生物酶的特异性，因此可以获得旋光度一定的产品。1996年，Budavari［3］报道可以用山梨糖菌或生膜菌作用于2，3－丁二醇制备3-羟基丁酮，或者通过曲霉菌、青霉菌等真菌作用于甘蔗汁来生产3-羟基丁酮，但这些工艺方法规模化应用仍存在诸多问题。DeFaveri［2］等2003年采用一种吸附了醇脱氢酶的膜式反应器，由汉氏醋杆菌(Acetobacter hansenii)全细胞催化2，3-丁二醇合成3-羟基丁酮考察了溶氧水平、P/O比例对酶催化反应的影响，在最适反应条件下2，3-丁二醇转化为3-羟基丁酮的最大摩尔转化率达71.6%，3-羟基丁酮的最高质量浓度达8.93g/L，并建立了转化过程的物质和能量平衡数学模型。

虽然酶转化工艺3-羟基丁酮得率较高，副产物较少，且产物具有旋光度，但酶法转化生产3-羟基丁酮主要是以丁二酮或丁二醇为原料，这一点与化学合成方法相类似，另外，酶的生产成本和性能是该工艺技术的关键，要获得大量特异性的酶存在很大困难。

2 微生物发酵法生产3-羟基丁酮

自20世纪初期发现部分微生物代谢糖类可以分泌3-羟基丁酮以来，它的生物合成与代谢调节等研究一直是人们关注的焦点。但相关报道多数是关于微生物代谢机制和基因调控方面的研究，少数涉及到3-羟基丁酮发酵的研究也主要是作为丁二酮和2，3-丁二醇发酵的副产物被提及到，而关于以糖质原料微生物发酵生产3-羟基丁酮的研究报道较少，且多数尚处于菌株选育等前期研究阶段。

2.1 产3-羟基丁酮的微生物菌株

3-羟基丁酮是许多微生物糖代谢的中间产物，普里斯考尔试验(Voges Proskauer test)就是以诊断菌株是否分泌羟3-基丁酮做为微生物分类的一种标记，其分泌对于微生物本身具有重要的生理意义。自然界可以转化糖生产3-羟基丁酮的微生物，主要包括肠杆菌属(Enterobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌属(Klebisella)、沙雷氏菌属(Serratia)以及乳球菌属(Lactococcus)等［4］。文献报道的产3-羟基丁酮菌株、使用的碳源及产率情况见表2。Zeng［6］等1991年报道利用产气节杆菌(A.aerogenes)发酵得到最终质量浓度为110g/L的2，3-丁二酮和3-羟基丁酮。Hikmet［7］等构建的高效表达血红蛋白(VHb)基因(vgb)的产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)工程菌羟基丁酮和丁二醇的产率提高83%。1996年 Hespell［1］报道在考察多粘杆菌(Bacillus polymyxa)发酵底物时发现部分菌株可利用木糖等生成2，3-丁二酮和3-羟基丁酮，以5%葡萄糖和5%的阿拉伯糖为底物，在温度30℃，pH7.0，250 r/min振荡培养条件下，3-羟基丁酮的产量达到11.3g/L，2，3-丁二醇的产量为2.3g/L。关于菌株产生2，3-丁二醇的同时产生3-羟基丁酮的报道很多，但多数菌株积累3-羟基丁酮的浓度都较低，做为生产菌株工业化发酵生产3-羟基丁酮是不可能的。Xu［2］等筛选得到1株短小芽孢杆菌 XH195(DSM16187)以葡萄糖或蔗糖为碳源，3-羟基丁酮的产率分别达63.0g/L和58.1g/L。赵祥颖和刘建军［8－9］等选育获得了1株高产3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌 SFA-H31(CGMCC1869)，3-羟基丁酮的发酵产量达到55.67g/L，且该菌株不产生丁二酮和2，3-丁二醇等副产物。以上2株菌是目前报道的产3-羟基丁酮比较高的菌株，是最有可能应用于发酵技术工业化生产3-羟基丁酮的菌株，尤其是菌株不产或少量积累丁二酮和2，3-丁二醇等副产物的性能，对其应用于3-羟基丁酮发酵生产是至关重要的。

与化学合成法及酶转化法相比，微生物发酵法生产3-羟基丁酮具有工艺简单、条件温和、环境友好，原料来源丰富且可以再生，产品可视为纯天然，安全性高等优点，是3-羟基丁酮最经济可行的生产方法。随着发酵法生产3-羟基丁酮研究的不断深入，采用先进的生物技术手段和传统育种技术相结合，选育、构建产率高、性能优良的生产菌株，同时注重发酵生产3-羟基丁酮的上下游技术的配套研究，是尽快实现生物发酵生产3-羟基丁酮的关键。

2.2 3-羟基丁酮的生物合成途径

早在20世纪40年代就开始研究3-羟基丁酮的形成机制，以后陆续的研究探明了细菌、酵母、植物以及动物肝脏等合成3-羟基丁酮的途径，在细菌中3-羟基丁酮是仅由丙酮酸开始合成的，在酵母和动物组织中是由丙酮酸和乙醛合成的，而在植物和某些动物组织中仅是由乙醛合成的，不同微生物之间以及植物、动物器官等合成3-羟基丁酮的途径都存在较大的差异。Juni［10］等以产气杆菌为研究对象，研究证实能够由丙酮酸形成羟基丁酮的细菌抽提物可以转化α-乙酰乳酸形成羟基丁酮，并有产气杆菌的细胞抽提液中分离出2种酶组分，一种组分作用于丙酮酸形成α-乙酰乳酸，另一种组分催化α-乙酰乳酸脱羧但对丙酮酸没有效果。后来证实前者为α-乙酰乳酸合酶，后者为α-乙酰乳酸脱羧酶。Harold［11］等研究证实3-羟基丁酮的形成与丙酮酸好氧氧化(进入三羧酸循环)或厌氧代谢(生成乳酸或乙醛)无关，而是存在着另一种途径形成3-羟基丁酮。

表2 产3-羟基丁酮菌株及产率［4－5］

在微生物3-羟基丁酮代谢相关的部分酶类方面还存在不同的观点，但到目前为止，大量生化、分子生物学的研究结果已经证实3-羟基丁酮的代谢途径主要涉及到糖类代谢的糖酵解(EMP)途径(葡萄糖到丙酮酸)和丙酮酸到3-羟基丁酮的转化过程，如图1。在微生物体内，合成3-羟基丁酮的途径主要有2种途径:2分子丙酮酸在α-乙酰乳酸合成酶的作用下合成一分子α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸在酸性条件下非酶自然氧化脱羧生成2，3-丁二酮，2，3-丁二酮在丁二酮还原酶或2，3-丁二醇脱氢酶的作用下还原生产3-羟基丁酮;另一条途径是2分子丙酮酸在α-乙酰乳酸合成酶的作用下合成1分子α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸经α-乙酰乳酸脱羧酶作用生成3-羟基丁酮。

图1 3-羟基丁酮的合成途径

由葡萄糖转化为3-羟基丁酮的反应过程如下:

由此计算的葡萄糖到3-羟基丁酮的理论转化率为:(88÷180)×100%=48.89%

随着生物及相关技术的发展，有关3-羟基丁酮代谢的相关酶类的分离与纯化，以及有关酶在离体情况下的催化行为的研究，进一步揭示了3-羟基丁酮在生物体内的合成代谢途径，为在基因水平上逐步揭示3-羟基丁酮代谢调控机制奠定了基础。

2.3 3-羟基丁酮的分解途径

正常情况下3-羟基丁酮在微生物体内是不会积累的，3-羟基丁酮即使微生物为了抵御不良环境而做为储存能源积累时，在葡萄糖等易同化碳源耗尽后也会被继续消耗来维持自身的生命活动，这充分表明微生物体内存在3-羟基丁酮的分解代谢体系。尽管早在20世纪20年代就开始研究3-羟基丁酮的分解代谢，但关于3-羟基丁酮的分解代谢仍存在不同的观点［4］。早期的研究认为3-羟基丁酮的降解是通过一个环形途径(2，3-丁二醇环)实现的。Juni［12］等对细菌代谢2，3-丁二醇、羟基丁酮和双乙酰的途径进行了详细研究，提出了能够以2，3-丁二醇或3-羟基丁酮做为唯一碳源生长的细菌体内存在一个环形途径转化这些化合物生产乙酸，并阐明了环形途径的构成及相关物质之间的转化过程，环形途径除了2，3-丁二醇、羟基丁酮和双乙酰以外主要涉及到2种新的中间产物 3-乙酰基-3-羟基丁酮和 3-乙酰基-2，3-丁二醇，在环形途径中双乙酰通过焦磷酸硫胺素催化的酮醇缩合反应被转化成3-乙酰基-3-羟基丁酮和乙酸，3-乙酰基-3-羟基丁酮被还原为3-乙酰基-2，3-丁二醇，依次被水解为2，3-丁二醇和乙酸，环形途径运行一个周期的效果就是一分子的3-羟基丁酮形成两分子的乙酸，乙酸是一种微生物可以迅速氧化的化合物，从而到达微生物利用2，3-丁二醇、羟基丁酮做为生长和能源底物的目的。以后又有许多学者对该途径进行了研究并陆续提出了不同的观点。Lopez［13］等研究提出枯草芽孢杆菌能够降解2，3-丁二醇环中所有的中间产物，但降解羟基丁酮并不需要一个完整的环，阻断环中两步反应的突变株可以和标准菌株一样代谢羟基丁酮。后来Lopez［14］等又研究了枯草芽孢杆菌中3-羟基丁酮以直接氧化裂解方式降解的过程，在枯草杆菌细胞抽提物中能够检测到羟基丁酮的直接氧化分解产物是乙酸和乙醛，在反应体系中没有检测到双乙酰并且证实缺失3-羟基丁酮裂解能力的突变株不能够利用葡糖糖耗尽后积累的羟基丁酮，催化由双乙酰生成3-乙酰基-3-羟基丁酮的3-乙酰基-3-羟基丁酮合酶可能与催化羟基丁酮裂解的酶是一致的。枯草杆菌直接裂解羟基丁酮生成两分子的乙醛，其中一分子的乙醛是一种活化形式被进一步氧化成为乙酸，这一结论显然与Juni［12］等提出的3-羟基丁酮通过2，3-丁二醇环形途径降解是不一致的。近20年来，关于3-羟基丁酮分解代谢的基因调控机制的研究已有很多报道，如Grundy［15］等研究提出了枯草芽孢杆菌的分解代谢产物乙酸和羟基丁酮利用基因由CcpA(球形调节蛋白)调节。Huang等［16］研究提出了3-羟基丁酮的分解与菌株acoA基因(编码依赖于焦磷酸硫胺素的羟基丁酮脱氢酶的α-亚单位)缺失有关，并认为早期关于3-羟基丁酮通过2，3-丁二醇环进行的降解的观点是一个错误的。越来越多的研究表明，在细菌中3-羟基丁酮通过3-羟基丁酮脱氢酶系(AoDH ES)直接氧化裂解途径降解更为普遍［17］。归纳起来，3-羟基丁酮在生物体内的降解途径如图2。

图2 3-羟基丁酮的分解代谢相关途径

2.4 3-羟基丁酮代谢相关的酶类

根据图1和图2，与3-羟基丁酮代谢有关的酶类主要涉及到催化丙酮酸到α-乙酰乳酸的α-乙酰乳酸合成酶(E1)、催化α-乙酰乳酸生成3-羟基丁酮的α-乙酰乳酸脱羧酶(E2)、催化2，3-丁二醇和3-羟基丁酮相互转化的2，3-丁二醇脱氢酶(E3)以及催化双乙酰到3-羟基丁酮的2，3-丁二醇脱氢酶(E3)和丁二酮还原酶(E4)。随着生化分离纯化技术的发展，关于3-羟基丁酮代谢相关酶类的研究很多，许多微生物中3-羟基丁酮代谢相关的酶类已经被分离纯化并研究了其性质［16－17］。

Juni［12］等研究发现以 2，3-丁二醇和矿物质培养基培养的细菌2，3-丁二醇脱氢酶失去底物特异性，可以催化2，3-丁二醇异化过程中的几个反应。由葡萄糖培养的几种微生物的2，3-丁二醇脱氢酶具有不同的底物特异性以及不同的底物亲和力，当产气杆菌生长在葡萄糖和3-羟基丁酮为碳源的培养基中时，形成不同的2，3-丁二醇脱氢酶。Klaus［18］等纯化了产气杆菌中催化双乙酰还原的酶(E4)和羟基丁酮和2，3-丁二醇可逆反应的酶(E3)到同质，纯化过程中两种酶的比率E3/E4是保持不变的，并推断两种反应由同一种酶催化，并建议命名该酶为双乙酰(羟基丁酮)还原酶。Oyvind［19］等研究了产气杆菌中双乙酰(羟基丁酮)还原酶的多样性，证实产气杆菌的双乙酰(羟基丁酮)还原酶纯酶至少由12种不同的蛋白组分组成，所有这些组分都有酶活性。Liv［20］等研究了产气杆菌双乙酰(羟基丁酮)还原酶催化双乙酰到羟基丁酮还原反应的的动力学，证实双乙酰(羟基丁酮)还原酶催化羟基丁酮到2，3-丁二醇的反应以及可逆反应和双乙酰到羟基丁酮的反应，这种酶是一种四聚体，是由4个相同大小的亚单位组成，2，3-丁二醇到羟基丁酮的反应受乙酸盐的抑制，并且发现在pH 5.8、乙酸缓冲液体系比其它缓冲液体系对应2，3-丁二醇的Km值增加了10倍。Zahler［21］等证实在枯草芽孢杆菌中存在2种可以催化α-乙酰乳酸合成的酶，一种是与支链氨基酸合成有关，催化一分子活性乙醛与一分子的丙酮酸缩合生成α-乙酰乳酸(支链氨基酸的前体)，另外一种α-乙酰乳酸合成酶催化两分子的丙酮酸缩合生成α-乙酰乳酸，与枯草芽孢杆菌稳定期3-羟基丁酮的产生有关。目前已经证实3-羟基丁酮的合成与支链氨基酸的合成共享一个前体物α-乙酰乳酸，两种催化α-乙酰乳酸形成的酶的存在也已经证实，与支链氨基酸合成有关的称为合成代谢α-乙酰乳酸形成酶或 α-乙酰羟酸合酶(α-acetohydroxy acid synthase，AHAS，E5)，与 3-羟基丁酮形成有关的称为分解代谢α-乙酰乳酸形成酶或α-乙酰乳酸合酶( α-acetolactatesynthase，ALS)［4］。 Holtzclaw［22］等对枯草芽孢杆菌降解性乙酰乳酸合酶进行了纯化并研究了酶的性质。3-羟基丁酮合成与分解酶类及其调节机制的深入研究，为定向改造3-羟基丁酮生产菌株，实现产物的高效积累提供了理论基础。有关3-羟基丁酮代谢仍由部分问题还不能定论，比如2，3-丁二醇脱氢酶或双乙酰还原酶催化的由双乙酰到3-羟基丁酮的反应是否是可逆的等问题仍有待进一步研究证实。

2.5 3-羟基丁酮代谢调节与积累机制

3-羟基丁酮是许多原核和真核微生物新陈代谢的产物，微生物代谢糖类分泌3-羟基丁酮对微生物本身具有重要的生理意义，比较公认的意义在于抵御环境的酸化、参与NAD/NADH比率的调节和做为储存碳源［4］。深入认识羟基丁酮的分解代谢源于对细菌3-羟基丁酮利用的多样性研究，如 Pelobacter carbinolicus，Clostridium magnum，Klebsiella pneumoniae，Bacillus subtilis，Alcaligenes eutrophus和 Pseudomonas putida，在这些细菌中发现3-羟基丁酮的分解代谢是由羟基丁酮脱氢酶酶系(AoDH ES)催化完成的，包括:依赖于焦磷酸硫胺素的羟基丁酮脱氢酶(AoDH E1)、二氢硫辛酰胺乙酰(基)转移酶(AoDH E2)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(AoDH E3)，并且AoDH E的结构基因acoA(编码AoDH E1的 α-亚单位)、acoB(编码 AoDH E1的 β-亚单位)和 acoC(编码AoDH E2)在染色体上呈线性依次排列。在P.carbinolicus，C.magnum和K.pneumoniae中，acoL基因(编码AoDH E3)也做为aco基因簇的一个部分［16－18］。Renna［23］等对枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶基因(alsS)、乙酰乳酸脱羧酶基因(alsD)和调节基因alsR进行了克隆和测序，并发现alsS和alsD同属一个操纵子，该操纵子的转录受alsR基因产物的调节，如果alsR遭到破坏，alsS就不能够表达。羟基丁酮做为额外的碳源储存物质在菌株对数生长期被储存和分泌，在稳定生长期以一种仍然不明确的途径被利用，在孢子形成期间发挥作用［16］。Grundy［15］等研究提出枯草芽胞杆菌利用乙酸和3-羟基丁酮基因由CcpA蛋白调节，并分离鉴定了ccpA基因下游的acu基因簇，并证实如果将acuA基因敲除，菌株利用3-羟基丁酮或2，3-丁二醇为碳源生长以及芽胞的形成均受到影响。Huang［16］等研究报道了枯草芽胞杆菌3-羟基丁酮分解代谢的生物化学和分子特征，提出了不同的观点，认为枯草芽孢杆菌分解代谢羟基丁酮的酶是由acu基因簇编码的，则完全不同于以前在所有其他能够利用羟基丁酮做为碳源生长的细菌菌株中发现的由aco基因簇编码的多组分构成的羟基丁酮脱氢酶酶系(AoDH ES)，以大梭菌(Clostridium magnum)含有AoDH ES的acoA、acoB基因片段为探针，与枯草芽孢杆菌基因组杂交，分离得到acoA、acoB、acoC、acoL和acoR等同源基因，并研究发现如果将acoA基因(编码AoDH E1的α-亚单位)敲除，细胞则不能利用培养基中的3-羟基丁酮或以3-羟基丁酮为唯一碳源生长，表明枯草芽孢杆菌利用3-羟基丁酮也是由aco基因簇控制的。根据3-羟基丁酮代谢分子调节机制分析，alsR基因突变可以使alsSD操纵子转录受阻，alsS基因缺失突变则细胞不积累3-羟基丁酮，acoA基因缺失突变细胞不能利用3-羟基丁酮为唯一碳源生长［16］。这一系列理论研究成果为采用基因工程手段构建3-羟基丁酮高产菌株奠定了基础。

2.6 3-羟基丁酮高产菌株构建策略

从高效积累3-羟基丁酮角度，菌株应具备E1、E2高活性而E3、E4缺失或低水平的特点。从代谢工程角度，切断分支代谢途径或降低分支代谢流也是非常有效的策略。Hikmet［7］等将带有编码透明颤菌属(Vitreoscilla)(细菌)血红蛋白(VHb)基因(vgb)的pUC8质粒克隆到产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)中，血红蛋白(VHb)基因(vgb)的表达增加了羟基丁酮/丁二醇代谢途径的代谢流，使菌株发酵产物羟基丁酮和丁二醇的产率提高83%。Zahler［21］等通过剔除合成代谢α-乙酰乳酸形成酶(E5)等手段获得一支分解代谢α-乙酰乳酸形成酶(E1)组成型突变株，该突变株在对数生长前期就开始产生3-羟基丁酮。为了获得高产3-羟基丁酮生产菌株一方面可以对现有的高产丁二酮或 2，3-丁二醇的菌株进行遗传改造，敲除acoA基因等编码E3、E4酶的相关基因或降低其基因转录水平;另一方面可以通过自然选育E1、E2活性高、E3、E4、E5酶水平低的3-羟基丁酮生产菌株。采用传统诱变与基因工程、代谢工程改造等先进育种技术相结合的手段，抑制丙酮酸、支链氨基酸代谢支路，改造、构建高产3-羟基丁酮生产菌株，突破微生物自身代谢调节机制，从而提高菌株生物合成3-羟基丁酮的能力，是实现3-羟基丁酮高效积累的关键。

2.7 3-羟基丁酮发酵

以3-羟基丁酮做为发酵目的产物的研究较少，3-羟基丁酮做为微生物代谢产物多数是关于奶制品发酵产生的风味物质或做为丁二酮和2，3-丁二醇发酵的副产物被提及到。韩丽［1］等通过常规诱变处理B.subtillis SFs-4获得1株高产3-羟基丁酮突变株F-d31，并对突变株生产3-羟基丁酮的发酵培养基和发酵条件进行了优化，以130g/L葡萄糖为主要原料，摇瓶发酵羟基丁酮发酵产率达到48.6g/L，采用16 L、50 L自动发酵罐对突变株F-d31 3-羟基丁酮发酵条件进行了初步研究，转速300 r/min，pH值6.0左右，3-羟基丁酮最高产率达55.7g/L，对糖转化率42.73%。Xiao［23］等采用响应面试验设计优化了Bacillus subtilis CICC 10025培养基，重点考察了糖蜜和豆饼水解液两种成分对3-羟基丁酮的影响，在摇瓶发酵中，3-羟基丁酮的产率为37.9g/L，糖蜜和豆饼水解液的最佳浓度分别是22.0%(v/v)和27.8%(v/v)，在5 L发酵罐中发酵56.4 h羟基丁酮的产率为35.4g/L。刘建军［9］等利用 Bacillus subtilis SFA-H31(CGMCC1869)以葡萄糖为主要原料，在50 L发酵罐中发酵培养52 h，转化率达到48.26%，3-羟基丁酮发酵产率达55.67g/L，并证实该菌株不产生副产物丁二酮和2，3-丁二醇。Xu［2］等筛选得到1株短小芽孢杆菌XH195(DSM16187)，以葡萄糖或蔗糖为碳源，37℃发酵60 h，3-羟基丁酮的产率分别达63.0g/L或58.1g/L。Teixeira［5］等2002年报道采用实验设计对高里有孢汉生假丝酵母(Hanseniaspora guilliermondii)3-羟基丁酮发酵进行了优化，其最初糖浓度6.8%，温度28℃，pH4～6时，3-羟基丁酮的产量最高可达0.36g/L。LEY［24］研究了多株醋酸菌以乳酸为主要底物生产3-羟基丁酮的情况，考察了底物浓度和通风对3-羟基丁酮的影响，底物的最大转化率达到理论转化率的74%，并提取获得了3-羟基丁酮的样品。李元芳［25］等研究了中间代谢产物与副产物对乙偶姻合成代谢的影响，认为3-羟基丁酮的发酵过程同时生成3-羟基丁酮与混合酸，葡萄糖作为唯一的碳源和能源物质，将沿着氧化和还原两个平行路径代谢，产生目的产物和副产物，伴生的其它终产物主要有丁二醇、丁二酮、乙酸、乳酸等有机酸，并研究发现利用蔗糖和柠檬酸有利于总体发酵水平的提高。发酵法生产3-羟基丁酮产业化的关键还是上游技术的首先突破，以上研究中部分菌株的3-羟基丁酮产率及性能已具备产业应用的潜力，尤其是不产或少量积累2，3-丁二醇、丁二酮的菌株Bacillus subtilis SFAH31(CGMCC1869)，采用传统技术与现代生物技术相结合进一步提高菌株产率，加强发酵、提取工艺及设备的配套研究，有望应用于工业化发酵生产3-羟基丁酮。

3 结束语

3-羟基丁酮作为一种食用香料和一种重要的平台化合物，其需求量日益增加，尤其是随着人们生活水平的不断提高，对食品的安全性提出了更高的要求，目前，国际上主要有美国JM公司、德国BASF公司和日本的信达公司生产3-羟基丁酮，国内主要包括江苏潘南香料厂、河南濮盟集团、上海泰禾化工有限公司、上海爱普香料有限公司以及上海凯信生物科技有限公司等。国内外3-羟基丁酮的生产仍然以化学合成工艺为主，产品的应用范围受到限制。据报道，目前国内已由企业开展了生物发酵法生产3-羟基丁酮的试生产工作，产品并取得了相关认证，为发酵法生产3-羟基丁酮的产业化奠定了基础。

来自于人口、资源、环境等方面的压力，以化石资源为原料的传统化工产业势必逐步被以可再生资源为原料、环境友好的新型生物化工产业所替代。开展环境友好、原料来源丰富、条件温和、产品可视为纯天然的微生物发酵法生产3-羟基丁酮的技术研究具有广阔的推广应用前景。

［1］韩丽.3-羟基丁酮高产菌株的选育及发酵条件研究［D］.济南:山东轻工业学院硕士论文，2007.

［2］纪晓俊，黄和，杜军，等.3-羟基丁酮的合成及应用进展［J］. 现代化工，2008，28(4):81.

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Present Research Situation of Acetoin Production by Biological Method

Xu Hui1，Jia Shi-ru1，Liu Jian-jun2
1(Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China)2(Key Laboratory of Food＆ Fermentation Engineering，Jinan 250013，China)

Acetoin(3-hydroxy-2-butanone)is an important flavor compound and platform chemical.It can be widely used in the industry of food，chemical and medicine.At present，the production methods of acetoin are mainly based on chemical synthetic menthods.Acetoin is an important physiological metabolite excreted by many microorganisms，In recent years，the demand of acetoin has been growing，so the production of acetoin by biological method has attracted people＇s attention.This paper described the present research situation of acetoin production by biological method，which mainly involves acetoin producing strains，metabolic mechanism，related enzymes and accumulation strategies.

acetoin，Strains，fermentation，production

博士研究生(贾士儒教授为通讯作者)。

2010－08－16