热处理过程中表没食子儿茶素没食子酸酯变化的动力学研究*

吴平，夏涛，高丽萍，戴前颖，王云生，李钊

(安徽农业大学教育部茶叶生物化学与生物技术重点实验室，安徽合肥，230036)

热处理过程中表没食子儿茶素没食子酸酯变化的动力学研究*

吴平，夏涛，高丽萍，戴前颖，王云生，李钊

(安徽农业大学教育部茶叶生物化学与生物技术重点实验室，安徽合肥，230036)

利用Arrhenius动力学方程，研究了不同热处理(4～100℃)条件下，表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)发生降解、异构化和脱没食子化反应的变化规律，并建立了相关的动力学预测模型。结果表明:热处理过程中EGCG发生的降解、异构化和脱没食子化反应均属于一级动力学反应，可用Arrhenius方程进行拟合(R2＞0.9)，反应速率常数K均随着温度的升高而增加，预测模型中的Ea(活化能)和A(频率因子)分别为53.90 kJ/mol和5.698×104、98.60 kJ/mol和7.315×1012、85.34 kJ/mol和5.112×1010，表明EGCG 易发生降解，而发生异构化反应难;各模型的预测值与实际值的相对误差＜13%，因此可根据Arrhenius方程对热处理条件下EGCG的变化进行预测。

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，降解，异构化，脱没食子化，动力学模型

儿茶素是以2-苯基苯并吡喃为基础结构的类黄酮化合物中的黄烷醇类［1］。在茶树鲜叶中儿茶素含量可以达到干重的12%～24%，而表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)又是其中的主体成分(50%～60%)［2］。自从1929年日本人首次从茶叶中提取分离出EGCG以来，许多科学工作者对EGCG生理功效进行了研究，发现它具有抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗衰老、抗菌消炎、降糖和降压等多种生物学功能［3－4］。

EGCG的稳定性较差，在加工和储藏过程中的湿热作用下，极易发生降解、氧化和异构化等反应，从而改变儿茶素原有的生理活性，并对茶饮料的茶汤品质产生不良影响［5－9］。温度、pH 值和金属离子等都影响着儿茶素稳定性，而温度是其中最关键的因子之一［10－13］。利用化学动力学模型研究环境因素对儿茶素稳定性、儿茶素氧化降解和异构化的影响，不仅可以深入探讨儿茶素变化的机理，也为茶饮料商品品质变化提供了监控手段。目前国内外的一些研究者已经利用化学动力学模型对冷藏鱼［14］、冷却肉［15］和刀豆［16］等生鲜及加工食品的品质变化进行研究，并且很好预测了其货架期。

本实验利用化学动力学模型及Arrhenius方程，对热处理条件下EGCG发生降解、异构化和脱没食子化反应的变化规律进行研究，并建立动力学预测模型，为解决儿茶素稳定性问题提供理论依据，并为实时监控茶饮料的生产销售过程中的儿茶素动态变化提出可行方案。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，购于福州日冕科技开发公司，纯度为90%;没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、没食子酸(GA)(纯度均为99.9%)的标准品，购于美国 Sigma公司;超纯水，杭州娃哈哈饮用水。实验用的甲醇、乙腈和乙酸为色谱级的试剂，购于 Tedia公司(USA)。

日本 Shimadzulc－20AD高效液相色谱仪，SPD6AV可调波长紫外检测器(日本岛津公司);LC－solution色谱工作站，数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)，TB－214Denver电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，KQ－500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 热处理实验

EGCG标准溶液的配制:称取1.000g的EGCG，用超纯水将其溶解并定容在1L的容量瓶中，配制成质量浓度为1.000mg/mL的标准溶液。

分别将 EGCG 标准溶液置于 4、20、40、60、80 和100℃水浴下处理不同时间。处理完毕后的溶液，用0.45μm的水相滤头进行过滤，用HPLC检测EGCG、GCG和GA的含量变化。

HPLC分析条件:色谱柱为Phenomenex Synergi4u Fusion－PR 80A(250 mm×4.60 mm);流动相A为1%的乙酸;流动相B为纯乙腈;流动相B的线性梯度变化0～20 min为10%～13%，21～40min为13%～30%，41 min回到10%;流速1.2mL/min;进样体积5μL;检测波长280 nm。

1.2.2 EGCG降解、异构化和脱没食子化的动力学模型建立

利用Excel软件和DPS处理系统，对不同热处理条件下反应溶液中残留的EGCG、产生的GCG和GA的含量进行回归分析，确定反应的级数，计算反应速率常数K，并计算反应活化能Ea及Arrhenius方程。

1.2.3 预测模型的验证和评价

为了验证建立的预测模型的准确性，将在60℃(333K)和100℃(373K)条件下分别处理240 min和120 min后检测反应溶液的EGCG、GCG和GA的实际含量与模型预测的结果进行了比较。

2 结果与分析

2.1 热处理条件下EGCG的变化

在热处理条件下，EGCG可能发生降解或水解、自动氧化、异构化和脱没食子化反应(图1)，EGCG自动氧化的产物为水溶性的有色物质。虽然从20世纪50年代至今，研究者对儿茶素的酶促和非酶促氧化产物进行了大量研究［17］，但在现有的检测条件下仍然难以对其定量分析。

Philip Coggon研究表明［18］，在茶多酚氧化酶作用下，约有2%被氧化的EGCG发生脱没食子酸化作用，产生三策啶(tricetinidin)和自由的没食子酸(GA)，即发生氧化脱没食子酸化作用(oxidative degallation)。另外，在微生物单宁酶作用下，EGCG还被水解为EGC和 GA［19－20］，而在茶树中也发现了类似的水解酶(文章待发表)。图2结果显示，在热处理条件下，随着EGCG的下降，有GA的产生，但没有EGC的出现。其中的GA是来自于EGCG水解还是氧化作用有待进一步确定。

图1 热处理条件下EGCG的变化

有许多资料表明，绿茶中的一些表儿茶素的异构体(epicatechin epimers)来自于加工过程的热处理作用［6，8，10］，图2结果显示，随着 EGCG 明显的减少，而其异构体GCG明显增加。

图2 热处理前(A)后(B)EGCG溶液的HPLC色谱图(100℃，120min)

2.2 热处理条件下EGCG的降解

图3 热处理条件下EGCG的降解(A，40～100℃;B，4～20℃)

图3中可以发现，随着热处理温度的增加，EGCG下降明显加速，置于4℃条件下的溶液，其EGCG降解缓慢，至20天时只降低降8.802%，而在100℃下仅处理10 min就下降了8.264%。

2.3 热处理条件下EGCG的异构化

从图4中可以发现，与EGCG变化相反，随着热处理温度的增加，EGCG的异构体GCG呈显著上升趋势，当温度较低时(4℃、40℃)，GCG的生成较缓慢，异构的量在反应20 d和12 h时分别只能达到0.490 8%、2.446%左右;当温度是 60、80℃时，GCG的生成量显著增加，分别反应10和6 h时可以达到10.53%、23.04%;当温度是100℃时，发现GCG的量大量增加，异构量在反应120 min时可以达到56.08%。试验表明，随温度的升高，EGCG异构化越显著，反应越迅速。

图4 热处理条件下EGCG的异构化(A，40～100℃;B，4～20℃)

2.4 热处理条件下EGCG的脱没食子化

从图5中可以发现，随着热处理温度的增加，GA的生成呈现上升趋势，当温度较低时(4、40℃)，EGCG的脱没食子酸的量比较少，且随时间的延长不会大量的增加。GA的量在反应20 d和12 h时分别只能达到0.402 3%、0.650 5%;当温度是60、80℃时，发现GA的量有显著增加，GA的量在反应10 h和6 h时可以达到5.424%、4.996%;当温度是100℃时，GA的量在反应120 min时能够达到9.547%。结果表明，随着温度的升高，EGCG发生脱没食子酸的反应几率越大。

图5 热处理条件下EGCG的脱没食子化(A，40～100℃;B，4～20℃)

2.5 热处理条件下EGCG变化的动力学模型

Labuza指出，在食品加工和储藏过程中，大多数与食品质量有关的品质变化都遵循零级或一级反应动力学规律［21］。Wang等指出在(25～100℃)时，EGCG的降解和异构都遵循一级反应动力学和Arrhenius方程［22］，即

式中:t为反应物反应的时间(min);A为反应物反应后的摩尔浓度;A0为反应物反应前的摩尔浓度;K为反应的反应速率常数(min－1)。

式中:K为反应的速率常数;Ea为反应的活化能(kJ/mol);A为频率因子;T为绝对温度(K);R为气体常数(8.3144×10－3kJ/mol);A和Ea都是与反应体系物质本性有关的经验常数。而反应速率常数K是温度的函数。

根据上述公式，对不同热处理下的ln(A/A0)对热处理时间t作图，可以得到一条斜率为反应速率常数K的直线。A0和A分别为热处理前后体系中的EGCG、GCG和GA的摩尔浓度，K为EGCG的降解、异构和脱没食子酸反应的速率常数(表1)。根据不同热处理下的反应速率常数K，用lnK对热力学温度的倒数(1/T)作图可以得到一条斜率为－Ea/R的直线，由此可以得到Arrhenius方程中的活化能Ea和频率因子A(表1)。

表1 热处理条件下EGCG变化的动力学模型参数

从表1结果可以看出，各热处理方程的线性关系良好(R2＞0.9)，表明回归方程具有较高的拟合度，反应属于一级反应动力学反应机理;EGCG的降解、异构和脱没食子酸反应速率常数K均随着温度的升高而增加的，即随着处理温度的升高，各反应的速率增大;EGCG降解反应的活化能最低、而EGCG异构化反应的活化能最高，说明不同反应对温度的敏感程度有差异，EGCG的降解反应最易发生，而异构反应最难发生;由各个反应的活化能Ea，再根据式(1)得到EGCG降解反应的预测模型A=A0e－kt。和EGCG异构和脱没食子酸反应的预测模型A=A0ekt。

其中:t为EGCG反应液处理的时间(min);A为EGCG反应溶液反应后其中残留的EGCG、产生的GCG和GA的含量的摩尔浓度(mmol/L);A0为EGCG反应溶液反应前其中EGCG、GCG和GA的摩尔浓度(mmol/L);K为分别为EGCG降解、异构和脱没食子酸反应的速率常数(min－1)。

2.6 预测模型的验证和评价

为了验证2.5建立的预测模型的准确性，将在60℃和100℃条件下分别处理240 min和120 min后反应溶液的EGCG、GCG和GA的实际含量与模型预测的结果进行了比较(表2)，结果表明实际含量和预测值的相对误差均在13%以内，因此利用本文建立的模型可以快速、可靠、实时地预测EGCG的变化。

表2 EGCG热处理的预测值和实验值的比较

3 结论和讨论

在茶叶加工制作或茶饮料的储存过程中，儿茶素是不稳定的，易发生降解、氧化和异构化反应，从而影响其商品价值［23－24］。已经有许多这些方面研究，并从化学动力学角度进行讨论，其中的关注点多集中在儿茶素的氧化机理上［25－27］。实际上，除了氧化聚合外，在茶叶加工或茶饮料的储存过程中，儿茶素的变化是复杂的，同时进行多方面的反应，目前尚没有建立化学动力学模型来应用于儿茶素的降解、氧化和异构化等反应。故利用化学动力学模型，综合考虑环境因素对儿茶素降解、氧化和异构化等反应的影响，才能正确理解儿茶素的变化，并判断其稳定性差的问题。

与Rong Wang的研究结果相似的是［12］，本研究发现，在不同热处理条件下，EGCG的降解、异构化和脱没食子化反应都遵循一级动力学反应，可以用Arrhenius方程进行拟合;从各反应的反应速率常数K和活化能Ea看，虽然EGCG的降解、异构化和脱没食子化反应，随着处理温度的升高，各反应速率都增大，但不同反应对温度的敏感程度有差异，EGCG降解最易发生，而异构化最难。由此推测，茶叶生产加工贮藏过程中，避免过高温度即可降低异构化。但由于EGCG降解的活化能较低，仅仅依靠降低温度的措施较难维持儿茶素的稳定性是不够的，所以需要结合食品级的添加剂或除氧等相关措施来控制缓解儿茶素在低温时的降解反应。

由于EGCG的氧化产物比较复杂，无法进行定量分析，故本研究无法计算EGCG氧化反应的活化能，并判断EGCG氧化反应发生的难易程度。因此，如何快速准确定量EGCG的氧化产物，是今后研究的重点。

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Kinetics Study on EGCG Changes During Thermal Processing

Wu Ping，Xia Tao，Gao Li-ping，Dai Qian-ying，Wang Yun-sheng，Li Zhao
(Kdy Laboratory of Tea Biochemistry and Biotechnology Ministry of Education，Anhui Agriculture University，Hefei 230036，China)

This paper studied the variation of degradation，epimerization and de-gallate acid reaction of Epigallocatechin Gallate(EGCG)under the conditions of different heat treatment(4～100℃)by using the Arrhenius equation，and established the related kinetic predicting model.The results showed that the degradation，epimerization and de-gallate acid reaction of EGCG complied with the first order reaction during heat treatment，the Arrhenius equation was able to be used to fit(R2＞ 0.9)，the rate constants went up as the temperature raised.The Ea(activation energy)and A(frequency factor)in prediction model were 53.90kJ/mol and 5.698 × 104，98.60kJ/mol and 7.315 ×1012，85.34kJ/mol and 5.112 × 1010，respectively，which indicating that the degradation of EGCG was the most easily reaction，and epimerization of EGCG was the most difficult reaction;the relative error of the model predicted value and actual value was less than 13%.Therefore，the changes of EGCG was able to be predicted according to Arrhenius equation under the condition of heat treatment.

EGCG，degradation，epimerization，de-gallate acid，kinetics model

硕士研究生(夏涛教授为通讯作者，E-mail:xiatao62@126.com)。

*教育部重点科技项目(02067)和安徽省人才基金项目资助内容

2010－06－11，改回日期:2010－09－13