酶法合成没食子酸叶黄素酯的研究

杨云裳，许建国，张应鹏*，李春雷

(兰州理工大学石油化工学院，甘肃 兰州 730050)

酶法合成没食子酸叶黄素酯的研究

杨云裳，许建国，张应鹏*，李春雷

(兰州理工大学石油化工学院，甘肃 兰州 730050)

以叶黄素和没食子酸为原料，在脂肪酶Novozym435的催化下，合成没食子酸叶黄素酯，并用IR对其结构进行表征。研究脂肪酶催化叶黄素与没食子酸合成没食子酸叶黄素酯的影响因素，考察酶量、溶剂、体系水分、温度、时间等因素对酯化反应的影响。结果表明，适宜的工艺条件为酶用量10mg/mL、溶剂为氯仿、初始加水量60mg/g、温度40℃、反应时间30h，在上述条件下没食子酸转化率可达81.8%。

没食子酸；叶黄素；脂肪酶；酯化反应

叶黄素分子中存在共轭双键，共轭双键对氧是极不稳定的，特别是纯的晶体更容易被氧化破坏。许多物理、化学、生物因素都影响到叶黄素的稳定性，例如氧、光辐射、高温、酸等[1]。据有关文献报道[2]，叶黄素在未避光保存条件下60d后其含量仅占原来样品中45%，而暴露空气中的叶黄素在60d后其叶黄素质量占原来样品中叶黄素质量的9.7%，叶黄素的不稳定性限制了其开发利用，文献报道，叶黄素酯的生物利用度大于纯叶黄素[3]。本实验把叶黄素与没食子酸合成没食子酸叶黄素酯，可以大大提高叶黄素的稳定性，没食子酸叶黄素酯在人体内水解成叶黄素和没食子酸，同时满足人们对没食子酸的需求。没食子酸具有广谱的抗菌、抗病毒、抗肿瘤[4]等药理作用。

传统化学方法合成没食子酸叶黄素酯，存在反应温度高，不利于叶黄素的稳定，而酶催化法具有反应条件温和，产物选择性高等优点。目前，国内外关于脂肪酶催化酯类合成的研究主要应用在山梨醇油酸、蜡酯、VA乳酸酯和风味酯[5]的合成。在合成叶黄素衍生物方面还未见报道。本实验以没食子酸、叶黄素作为底物，考察各因素对于酯化反应的影响，对反应条件进行摸索。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

固定化脂肪酶(Novozym435) 诺维信(中国)生物技术有限公司；没食子酸、氧化镁、叶黄素、丙酮、乙醇、甲苯、氯仿、正己烷、石油醚均为分析纯；分子筛(4A°) 上海国药集团化学试剂有限公司；硅胶(100～200目、200～300目) 青岛海洋化工有限公司。

THZ-92B气浴恒温振荡器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；AC-400核磁共振波谱仪 中科院武汉波谱公司；Nexus 670FT-IR型傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo Nicolet公司；RE-52A真空旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；DZF-6021真空干燥箱 上海中友仪器设备有限公司；FA1004电子分析天平 上海恒平科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 没食子酸叶黄素酯的合成[6]

准确称取叶黄素56mg(0.1mmol)和没食子酸34mg(0.2mmol)(物质的量的比为1:2)，置于10mL具塞锥形瓶中，加入1.0mL脱水的氯仿，然后加入10mg脂肪酶(Novozym435)，充入氮气，于40℃气浴摇床下，避光振荡反应12h，然后加入15mg活化的4A°分子筛，再继续反应12h停止。

1.2.2 没食子酸叶黄素酯的分离纯化

在层析柱中装入一层脱脂棉，并用石油醚润湿冲实。称取15g硅胶(200～300目)，15g氧化镁，充分搅拌使两者混合均匀后加入柱子中，用石油醚反复冲几遍，使柱子中的硅胶和氧化镁冲实加固。用移液管小心地将待分离的没食子酸叶黄素酯移入玻璃皿中，然后称取2g硅胶(100～200目)将其拌干，再加入柱子中。先用石油醚作为洗脱剂，由于没食子酸叶黄素酯的极性较小，所以用石油醚就可以将它冲下，当点样无原料点下来时，换用石油醚:丙酮:甲醇=85:15:1(V/V)的溶剂作为洗脱剂继续冲洗，点样直到无点后，换用石油醚:丙酮=7:1的溶剂作为洗脱剂继续冲洗。最后换用乙酸乙酯作为洗脱剂，直到柱子冲洗干净后认为没食子酸叶黄素酯已全被冲下。收集没食子酸叶黄素酯，浓缩即得。

1.2.3 没食子酸转化率的计算

式中：m1、m2为反应前、后的样品质量/mg；V1、V2为反应前、后滴定所用氢氧化钠的量/mL。

2 结果与分析

2.1 没食子酸叶黄素酯的合成及分离纯化

在有机介质中，脂肪酶的催化具有专一性和特异性[7]，催化没食子酸分子与叶黄素分子直接进行酯化反应。没食子酸叶黄素酯得率81%。

2.2 没食子酸叶黄素酯的结构表征

2.2.1 没食子酸叶黄素酯的红外(IR)分析

对硅胶柱层析分离纯化得到的没食子酸叶黄素酯作红外分析，结果见图1。3448cm-1处的强吸收峰为没食子酸上－OH的吸收峰，1713cm-1处的强吸收峰为酯C=O的伸缩振动峰[8]，是酯的特征吸收峰。以上分析说明，没食子酸和叶黄素在脂肪酶的催化下已经发生酯化反应，生成了没食子酸叶黄素酯。

图1 没食子酸叶黄素酯的红外图谱Fig.1 IR spectrum of gallic acid lutein ester

2.2.2 没食子酸叶黄素酯的核磁H谱(400MHz，CDCl3)

由产物核磁H谱数据(图2)可知，产物图谱中6.968～7.521为没食子酸苯环氢的化学位移，4.196为叶黄素结构式上－CH=CH2氢的化学位移，证明产物中有没食子酸和叶黄素结构。

图2 没食子酸叶黄素酯的核磁H谱(1HNMR)图谱Fig.2 1HNMR spectrum of gallic acid lutein ester

2.3 初始加水量对反应的影响

图3 初始加水量对转化率的影响Fig.3 Effect of initial water content on conversion rate of gallic acid

水对脂肪酶的影响有两个方面。一方面，酶需要少量的水以保持活性的三维结构状态，水可以保持催化部位的整体性，催化部位的极化、蛋白质的稳定。另一方面，水含量过高，酶构象柔性过大，酶构象将向疏水环境下热力学稳定的状态变化，引起酶结构的改变和失活，同时又限制了疏水性底物在酶分子附近的溶解性。只有水量适宜时酶表现出最大活力[9]。多次实验发现，加水量为60mg/g比较合适(图3)。既保持酶活性的三维结构状态又促进反应进行。

2.4 有机溶剂对反应的影响

在使用不同的酶或者在不同的反应体系中，最适于使用的有机溶剂也是不同的。有机溶剂影响酶催化的途径有3种：一是有机溶剂与酶直接发生作用，通过干扰氢键和疏水键等改变酶的构象，从而导致酶的活性被抑制或酶的失活；二是有机溶剂和能扩散的底物或产物相互作用，影响正常酶催化反应的进行；三是有机溶剂还可以直接和酶所需的必需水相互作用。一般认为在非水介质中添加亲水性或和水互溶性的有机溶剂对反应不利，因为它们会夺取酶周围微环境的必需水，从而使酶失活，所以选择的有机溶剂疏水性越强越好[10]。由图4可知，氯仿比较合适。

图4 有机溶剂对转化率的影响Fig.4 Effect of organic solvent type on conversion rate of gallic acid

2.5 反应温度对反应的影响

图5 反应温度对转化率的影响Fig.5 Effect of reaction temperature on conversion rate of gallic acid

固定化酶Novozym435在100℃仍保持较高的酶活性。为此，在其他条件不变的情况下，只改变反应温度观察对转化率的影响，具体结果见图5。结果显示随温度的升高转化率增加，但温度过高(＞50℃)对叶黄素的稳定不利[2]，实验表明40℃比较合适。

2.6 反应时间对酯化反应的影响

反应时间对酯化反应的影响见图6，反应的转化率随着反应时间的延长而提高，但30h后转化率的增长趋势不明显，可能由于反应时间过长，酶的机械损耗增大，活力丧失，影响酯化反应进行[11]。所以总体时间应控制在30h。

图6 反应时间对转化率的影响Fig.6 Effect of reaction time on conversion rate of gallic acid

2.7 酶用量对反应的影响

在叶黄素加量20.1mg、叶黄素与没食子酸物质的量的比1:2、加入氯仿1.0mL、反应温度40℃、反应时间24h条件下，考察酶用量对转化率的影响，结果见图7。

图7 酶用量对转化率的影响Fig.7 Effect of enzyme load on conversion rate of gallic acid

由图7可知，随着酶用量增加，反应速度加快，酯化率增高。但酶用量达10mg/mL后，酶用量进一步增加，酯化率反而有降低的趋势，这是由于过多的酶使反应初始生成的副产物水增加，过多的水会使反应向负反应进行，并且可能导致酶失活[12]。所以酶用量为10mg/mL较合适。

3 结 论

本实验通过酯化反应，利用固定化脂肪酶催化叶黄素与没食子酸合成没食子酸叶黄素酯，并对影响此反应的各种因素进行了系统的研究。反应经初步优化得到的条件为酶用量10mg/mL、溶剂为氯仿、初始加水量60mg/g、温度40℃、反应时间30h，在上述条件下没食子酸转化率可达81.8%。

[1] 徐任生. 天然产物化学[M]. 北京: 科学出版社, 2004: 3-23.

[2] 杨云裳, 张海霞, 李春雷, 等. 万寿菊叶黄素的超声提取工艺研究[J].食品研究与开发, 2007(1): 97-99.

[3] 张艳, 惠伯棣. 叶黄素单体与酯的生物接近度比较[J]. 中国食品添加剂, 2008(5): 81-86.

[4] 王之德. 重要精细化学品: 没食子酸[J]. 天然气化工, 1995, 20(1):34-39.

[5] 刘楚怡, 薛文通, 张惠. 非水介质中脂肪酶催化合成酯类的研究进展[J]. 食品工业科技, 2009(12): 424-426.

[6] 张春鸣, 赵文秀, 陈峰, 等. 单辛酸甘油酯的酶法合成[J]. 食品科学,2007, 28(11): 360-364.

[7] 蔡水根, 陶冠军, 秦昉 等.L-抗坏血酸月桂酸酯的酶法合成、分离及其性质[J]. 食品工业科技, 2008, 29(10): 211-214.

[8] 吴谋成. 仪器分析[M]. 北京: 科学出版社, 2003.

[9] 石红旗, 林学政, 缪锦来, 等. 溶剂体系酶催化酸解反应合成富含共轭亚油酸甘油酯的研究[J]. 中国食品学报, 2004(4): 257-265.

[10] 曹淑桂. 有机溶剂中酶催化研究的新进展[J]. 化学通报, 1995(5): 5-11.

[11] GUO Zheng, SUN Yan. Solvent-free production of 1,3-diglyceride of CLA: Strategy consideration and protocol design[J]. Food Chemistry,2007, 100(3): 1076-1084.

[12] SABEDER S, HABULIN M, KNEZ Z. Lipase-catalyzed synthesis of fatty acid fructose esters[J]. Journal of Food Engineering, 2006, 77(4):880-886.

Lipase-catalyzed Synthesis of Gallic Acid Lutein Ester

YANG Yun-shang，XU Jian-guo，ZHANG Ying-peng*，LI Chun-lei
(School of Petrochemical Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China)

Lutein and gallic acid were used as the raw materials to synthesize gallic acid lutein ester through the catalysis of Lipozyme Novo 435. The structure of the synthesized product was determined by IR. The effects of enzyme load, solvent, and water content, reaction temperature and reaction time on the esterification were investigated. The optimal reaction conditions were determined as follows: enzyme load, 10 mg/mL; water content, 60 mg/g; reaction medium, chloroform; reaction temperature,40 ℃; and reaction time, 30 h. The conversion rate of gallic acid was up to 81.8% under these conditions.

gallic acid；lutein；lipase；esterification

Q814

A

1002-6630(2010)20-0093-04

2010-01-04

杨云裳(1972—)，女，副教授，博士，研究方向为生物有机化学。E-mail：yangguang@lut.cn

*通信作者：张应鹏(1970—)，男，副教授，博士，研究方向为有机化学。E-mail：yingpengzhang@126.com