黄芪对去卵巢大鼠骨组织的动态影响

潘静华，张海啸，2，李芳芳，尹智炜，李 恩

(1.福建医科大学附属厦门第一医院，福建厦门 361003;2.中国中医科学院，北京 100700;3.河北医科大学基础医学院，石家庄 050017)

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是绝经后妇女常见代谢性骨病，其特征是骨量减少、骨组织的显微结构改变，骨折的危险性加大。据预测，我国原发性骨质疏松人数约为8800万人，约占人口总数的6.97%。在我国女性60岁以上、男性75岁以上都患有不同程度的骨质疏松［1］。骨质疏松症已经成为威胁老年人健康的重大问题之一。

骨质疏松的发病率以绝经后妇女人群为最高，可达50%以上，其主要原因是体内雌激素水平迅速降低，引起骨吸收相对增加，导致高转换型骨质疏松的发生。大鼠去卵巢后所发生的骨丢失与绝经引起的骨丢失有许多共同之处，该模型已广泛用于绝经后骨质疏松防治药物的筛选及疗效的评价［2、3］。

当前西药治疗骨质疏松常采用激素替代治疗抑制高转换型骨代谢和二磷酸盐抑制骨吸收为主。但是由于雌激素(E2)可增加患子宫癌和乳腺癌的危险性、阿仑磷酸钠(ALN)对胃肠道的副作用，限制了临床的应用。因而在中医理论的指导下，从天然植物药中寻找有效的治疗药物或有效成分已成为关注的热点。已有的研究结果表明，补益类中药在骨质疏松的防治中占有重要的地位，达70%以上［4］。黄芪为补药之长，能“助气壮筋骨，长肉补血，实皮毛”。在临床中常用于脾气不足型骨质疏松的治疗，文献研究显示其在抗骨质疏松复方中应用的频率较高［4］。实验研究已经证实，黄芪对骨质疏松的防治作用确切，但是其对去卵巢大鼠骨组织的动态影响尚未见报道。

1 材料

黄芪生药切片购于石家庄市乐仁堂药材公司;尼尔雌醇由北京四环制药厂生产，批号20010801;碱性磷酸酶测定试剂盒由石家庄试剂公司生产;抗酒石酸酸性磷酸酶试剂盒为南京建成生物试剂公司产品;血钙测定试剂盒为首都医科大学科技中心生产;血磷测定试剂盒由石家庄试剂公司生产，其余试剂均为国产或进口分析纯。

2 方法

2.1 动物模型的建立、分组和处理

6月龄SD雌性大鼠64只，购自同济医科大学实验动物中心，动物合格证号020509。大鼠平均体重为256g±31g，随机分为4组，即假手术组(Sham组)、卵巢切除组(OVX组)、卵巢切除 +黄芪组(HSW组)、卵巢切除 +尼尔雌醇组(E2组)，每组16只。动物麻醉后摘除双侧卵巢，Sham组切除同样大小的脂肪。各组大鼠于卵巢切除30d后开始灌胃给药，黄芪(1.8g/kg·d)、E2(0.1mg/kg，每周 2次)、Sham组与OVX组给予等量蒸馏水灌胃。于给药后第15天将各组半数动物取血后处死。

2.2 中药的制备

将黄芪生药切片加3倍量蒸馏水浸润4h，煮沸回流1.5h过滤，再加3倍量蒸馏水煮沸回流、过滤2次，合并3次滤液浓缩至0.18g/ml。

2.3 血清ALP和TRAP的测定

ALP采用氨基氨替吡啉酚法，TRAP采用对硝基苯磷酸二钠法。

2.4 骨组织ALP和TRAP的测定

从－70℃取出骨标本，分离右后股骨，去除股骨端软骨盘和连接组织，剪取股骨近心端约1/3，用冰冷的柠檬酸缓冲液冲洗骨髓腔数次直至冲洗液无红色为止，快速称重后加柠檬酸缓冲液于研钵(置于冰盒中)中研磨，约0.5g骨组织加4mL柠檬酸缓冲液，组织研磨液离心(4℃ 12000r 10min)，上清液－70℃保存，用于测定ALP和TRAP，总蛋白测定应用考马斯亮蓝法。

2.5 骨组织HOP、钙、磷的测定

从－70℃取出骨标本，分离右后胫骨，去除胫骨端软骨盘和连接组织，剪取胫骨近心端约1/3，用双蒸水冲洗骨髓腔数次直至冲洗液无红色为止。于烤箱中80℃ 48h烘干、称重。每份骨样本加6mol/L HCl 3ml高温(125℃)消化，消化液分成2等份，第1份消化液稀释后用甲基麝香草酚兰比色法测定钙，采用钼酸铵氧化法测定磷;第2份消化液采用改良的氯氨-T氧化法测定骨HOP，用骨钙总量/骨干重比值、骨磷总量/骨干重比值作为骨矿物质含量的指标，用骨(HOP×12.5)/(骨干重×0.9)的值作为骨有机质(bone organic)含量的指标。

2.6 骨组织病理切片

4%多聚甲醛固定，EDTA脱钙后，常规组织脱水、透明、浸蜡、包埋、石蜡切片和HE染色，显微镜下观察并照相，照相位置选择股关节盘下10μm处。

2.7 数据统计分析

采用SPSS11.0统计软件进行实验数据处理，参数用均数±标准差(珋x±s)表示，组间比较用q检验。

3 结果

3.1 黄芪对骨有机质和矿物质的动态影响

表1显示，与Sham组比较，2个阶段OVX组的骨有机质、骨磷相对含量明显降低(P<0.05和P<0.001)，骨钙在治疗15d时出现一定的降低，但未出现统计学差异，在第30天时方出现明显的降低(P<0.05)。同OVX组比较，E2组治疗15d和30d时的骨有机质、骨磷相对含量明显升高(P<0.05和P<0.001)，HQ组的骨有机质相对含量在30d时出现明显增加(P<0.001)，骨磷相对含量在治疗的15d和30d时均出现统计学意义的升高，但是骨钙在2个药物组、2个时间段中均没有明显改善。

表1 去卵巢大鼠骨组织中有机质及矿物质钙、磷相对含量的变化(%，珋x±s)

3.2 黄芪对ALP的动态影响

表2显示，与Sham组比较，第15天时OVX组血清ALP活性无明显差异，而骨ALP活性升高(P<0.05);在第30天时OVX组血清和骨ALP活性均明显升高(P<0.05)。HQ组同OVX组比较，治疗15d时血清和骨组织ALP活性没有出现明显的改变，而在30d时出现明显的增加(P<0.05)，而E2组未见到明显的变化。

表2 去卵巢大鼠血清和骨组织中ALP的变化(IU/L，珋x±s)

3.3 黄芪对TRAP的动态影响

表3显示，在2个治疗阶段 OVX组的血清TRAP活性与Sham组比较，无明显变化，而骨TRAP活性明显增加(P<0.05)。同OVX组比较，E2组治疗30d时骨TRAP活性有明显降低(P<0.05)，而HQ组的TRAP活性仅见到降低趋势，无统计学意义。

表3 去卵巢大鼠血清和骨组织中TRAP的变化(IU/L，珋x±s)

3.4 大鼠股骨组织病理改变

图1显示，在治疗第15天、30天时，均可见到OVX组股骨的骨小梁稀疏变薄，骨髓腔扩大，可见到骨小梁断裂，排列不整，且卵巢切除大鼠的骨组织稀疏状态随着时间的延长而加重。而黄芪和尼尔雌醇应用后，骨小梁有所增厚，数目增加，骨小梁断裂减少。

图1 去卵巢大鼠用药治疗30d时的股骨组织形态图片(×40)

4 讨论

骨组织由骨的基本多细胞单位(BMU)，通过破骨-成骨(骨转换)的偶联活动，自我更新、重建。伴随绝经而来的雌激素不足，引起单位时间内BMU数量增加，即骨转换频率增多，并且在每次骨转换中，破骨多于成骨(失偶联)，骨代谢出现明显负平衡，骨组织量减少加速。其病理变化主要表现为骨有机基质和骨矿物质的减少。骨有机质中的主要成分是骨胶原纤维，即通常所说的骨胶原(bone collagen)，约占骨有机质的90%。并且与胶原蛋白中羟脯氨酸含量相对一致，约占胶原氨基酸的12.5%左右，因此测定骨HOP含量可推知骨组织中有机质的含量。骨矿物质是由无定形的钙磷混合物和钙羟磷灰石晶体构成。体内钙含量的99%存在于骨骼中，骨骼形成后，骨组织中的钙并不是固定不变的。体内磷的85%存在于骨中，其主要作用是促进骨基质的合成和骨矿沉积。磷的释放总伴随骨的破坏，故测定钙、磷的相对含量可推测骨中无机质的状况［5］。

当破骨细胞活性占优势时，骨胶原和骨磷、钙的量减少，当成骨细胞活性占优势时，骨胶原和骨磷、钙的量增加，因此骨胶原和骨磷、钙的量可以灵敏地反映骨组织破骨细胞和成骨细胞活性的相对强弱［6、7］。在本试验中我们观察到，在去卵巢骨质疏松大鼠的骨组织中，骨有机质、骨矿物质(钙、磷)均随时间的延长而呈进行性减少。在用药治疗15d时的骨有机质和骨磷升高，说明使用中药黄芪可影响到骨组织，迅速改善骨有机质和骨磷的含量，使骨丢失有所减少。并且在大鼠去卵巢后的早期阶段，骨磷的改变快于骨钙，可能与钙盐的代谢较慢有关。

综合病理和骨有机质和骨矿物质的检测结果来看，黄芪与尼尔雌醇具有相似的治疗作用。然而，其作用机理是否也相似呢?由于在骨重建过程中，破骨细胞分泌酸和酶来溶解吸收旧骨，成骨细胞分泌酶和骨胶原等蛋白以助骨钙沉积，生成新骨。TRAP是破骨细胞的标志酶，其活性高低反映了破骨细胞活性的强弱，ALP是成骨细胞的标志酶［8］，其活性高低反映成骨细胞活性的强弱。在本实验中我们发现，尼尔雌醇对TRAP活性的改变出现明显抑制，而ALP活性并未见到明显的改变;黄芪对血清和骨组织中成骨细胞的标志酶ALP活性明显增强，而仅见到降低TRAP活性的趋势。这说明短期应用尼尔雌醇主要抑制破骨细胞的活性，而黄芪主要促进成骨细胞的活性。

总之，通过本研究我们发现，黄芪能改善去卵巢大鼠骨有机质和骨磷的减少，改善骨组织形态，随着用药时程的增加，对骨组织的改善作用更为明显;增强ALP活性，尤其骨组织ALP活性可能是黄芪防治骨质疏松的主要机理。

［1］ 朴俊红，庞莲萍，刘忠厚，等.中国人口状况及原发性骨质疏松症诊断标准和发生率［J］.中国骨质疏松杂志，2002，8(1):1-7.

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［4］ 李芳芳，张海啸.骨质疏松症中医复方用药分析及单味药研究进展［J］.河北中医药学报，2004，19(2):37-40.

［5］ 刘忠厚.骨质疏松学［M］.北京:科学出版社，1998.142.

［6］ Shen V，Birchman R，Xu R，et al.Short-Term Changes in Histomorphometric and Biochemical Turnover Markers and Bone Mineral Density in Estrogen and/or Dietary Calcium-Deficient Rats［J］.Bone，1995，16(1):149-156.

［7］ Srivastava AK，Vliet EL，Lewiecki EM，et al.Clinical use of serum and urine bone markers in the management of osteoporosis［J］.Curr Med Res Opin，2005，21(7):1015-1026.