中药复方抗纤抑癌方和复方鳖甲软肝片不同采血时间点药物血清对Hep G2肝癌细胞增殖活性的影响

赵志敏，叶永安，杨先照，甘大楠，马贺成，刘 方

(北京中医药大学东直门医院，北京 100700)

0 引言

药物血清因其方法学上的特点而使其在中医学的研究中具有一定的优势［1］，也是中医药研究的重要手段。目前研究采用人来源的药物血清日益增多，但是中药多是复方，成分复杂多样，多数中药人体药物代谢动力学不明，在不同时间点收集到的药物血清作用效果可能会存在差异。本实验我们选取叶永安教授临床治疗原发性肝癌较为有效的方剂复方抗纤抑癌方与中成药复方鳖甲软肝片制备人来源药物血清，采用MTT法检测不同抽血时间点、不同药物的药物血清对HepG2细胞增殖是否存在差异。

1 材料与方法

1.1 材料

人药物血清取自3名健康志愿者，男性，年龄25岁～32岁之间，了解实验目的并签订知情同意书，服药前后各检查血尿便常规、肝肾功、心电图1次。

药品:复方抗纤抑癌方:柴胡、黄芪、山药等。饮片购自东直门医院中药房。复方鳖甲软肝片由内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司生产，批准文号国药准字 Z19991011，0.5g/片，批号20090322;

细胞:HepG2人肝癌细胞，购自武汉中国典型培养物保藏中心，常规复苏、传代后，在37℃5%CO2条件下细胞培养箱内培养待用。

试剂:噻唑兰(Sigma)购自北京优博奥生物技术有限公司;二甲基亚砜(DMSO)购自sigma公司;MEM培养基干粉购自GIBCO公司;胎牛血清购自HyClone公司;胰蛋白酶购自Solarbio。实验于北京中医药大学中医内科学重点实验室完成。

1.2 方法

1.2.1 含药血清制备 志愿者在服药前空腹抽血1次，制备服药前空白对照血清;在服用复方抗纤抑癌方3d后，第4天晨起空腹服药后0.5h、1h、2h各抽血1次，制备复方抗纤抑癌方药物血清;在服用复方鳖甲软肝片3d后，第4天晨起空腹服药后1h、2h 抽血，每次8ml，室温静置 30min，离心分离血清(4000r/min，20min)，56℃ 30min 灭活、分装，于 －70℃保存备用。服用2种药物之间间隔1周作为洗脱期。

1.2.2 分组 我们先将1h、2h采集的复方抗纤抑癌方和复方鳖甲软肝片药物血清用无血清MEM培养基配成20%、10%、5%共3个浓度，同时设无血清MEM组为对照组，观察不同抽血时间点药物血清作用下的HepG2肝癌细胞生长状态。之后追加0.5h采集的复方抗纤抑癌方药物血清与其自身1h、2h采血点比较，药物血清用无血清MEM培养基配成20%、10%、5%共3个浓度，同时设无血清MEM组为对照组。最后将0.5h采集的复方抗纤抑癌方药物血清、2h采集的复方鳖甲软肝片药物血清与服药前空白对照组血清进行比较，3种血清用无血清MEM培养基配成40%、20%、10%共3个浓度。

1.2.3 细胞培养 人肝癌细胞HepG2培养于10%胎牛血清MEM培养液中，37℃5%CO2条件下培养，隔天换液，4d～5d传代，待细胞接近长满时，用0.25%胰蛋白酶消化液消化传代。

1.2.4 志愿者药物血清对HepG2人肝癌细胞增殖的影响 采用MTT法检测。取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×105ml－，接种于96孔板上，每孔100μl。24h后将原培养液吸弃，换无血清MEM培养液，每孔100μl，继续孵育。24h后将培养液吸弃，复方鳖甲软肝片组和抗纤抑癌方组分别加入含不同浓度药物血清的条件培养基，每孔100μl。另设无血清MEM组(或服药前空白血清组)为对照，每组设3个复孔。分别培养24h后，将原培养液吸弃，换无血清 MEM 培养液，每孔100μl，再加入5mg/ml MTT 每孔 20μl，孵育 4h，弃上清，每孔加DMSO 150μl，震荡5min，充分溶解沉淀后，于酶联免疫检测仪492nm处检测吸光度数值(OD值)。

1.2.5 统计学处理 实验数据用SPSS13.0软件处理。数据用珋x±s表示，计量资料的多组比较采用方差分析。

2 结果

2.1 1h、2hKX对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响

表1显示，KX各组与MEM组比较，均有统计学意义，说明无论1h还是2h抽血，KX各组对HepG2肝癌细胞均有明显的增殖抑制作用。整体来看，KX 1h各血清浓度对HepG2肝癌细胞的抑制效果强于2h，其中KX1h20%浓度时，抑制效果明显优于KX2h20%浓度，有统计学意义。

表1 不同时间点、不同浓度KX对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响

2.2 1h、2h复方鳖甲软肝片药物血清(BJ)对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响

表2显示，BJ各组与MEM组比较，均有统计学意义，说明无论1h还是2h抽血，BJ各组对HepG2肝癌细胞均有明显的增殖抑制作用。从数值上来看，存在BJ 2h各血清浓度对HepG2肝癌细胞的增殖抑制效果高于1h的趋势。

表2 不同时间点、不同浓度BJ对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响

2.3 服药后1h采血，2种药物血清对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响

表3显示，各治疗组与MEM组比较，均有统计学意义，说明2种药物血清对HepG2肝癌细胞均有明显的增殖抑制作用。服药后1h，KX在10%、5%浓度较BJ抑制作用强，其中5%浓度时有统计学意义。

2.4 服药后2h采血，2种药物血清对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响

表4显示，各治疗组与MEM组比较，均有统计学意义，说明2种药物血清对HepG2肝癌细胞均有明显的增殖抑制作用。服药后2h，BJ在3个浓度点上均较KX抑制作用强，其中20%、10%浓度时有统计学意义。

表3 服药后1hKX、BJ对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响

表4 服药后2hKX、BJ对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响

2.5 增加0.5h抽血时间点后KX对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响

表5显示，KX各组与MEM组比较，均有统计学意义，说明KX各组对HepG2肝癌细胞均有明显的增殖抑制作用。KX 0.5h各浓度对HepG2肝癌细胞的抑制效果均明显高于2h，有统计学意义。

表5 不同时间点、不同浓度KX对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响

2.6 0.5h的KX与2h的BJ对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响

表6显示，整体来看，KX 0.5h各血清浓度对HepG2肝癌细胞的增殖抑制效果强于BJ2h，其中KX0.5h40%浓度时抑制效果明显，有统计学意义;BJ各组与同浓度服药前比较无统计学意义。

3 讨论

药物血清一直以来都是体外研究的重要手段之一，既往药物血清主要来源于动物，对实验动物药物血清的采血时间点也有专门的研究［2］。随着实验技术的发展，研究者逐渐意识到实验用材料的种属问题［3］，它包括两个层面的意义:一是种属一致。应该使用同种动物的药物血清作用于同种动物的细胞，避免与实验不相关的因素干扰实验结果;二是种属相近。目前体外实验多采用人来源的细胞，即应当采用最接近人体的实验条件，实验结果才能够最大限度的接近实际。但药物血清多数还是来源于动物，在人的细胞上添加动物血清作为刺激因素，存在不合理性。也有报道，采集人血清进行药物血清实验，也存在一定的问题，多数中药的药物代谢动力学不明，统一的采血时间点不能保证2种以上不同药物在采血时均已达到该药的峰值，药物剂型不同，吸收代谢也不同。

表6 0.5h的KX与2h的BJ对Hep G2人肝癌细胞增殖活性的影响(作用48h)

本实验选取2种药物剂型，即汤剂和中成药片剂，两者药物成分不同。健康志愿者3名，且3人的药物血清不混合，测试2种药物服用后不同时间点采集的药物血清对肿瘤细胞的影响。结果显示，2种药物血清对HepG2人肝癌细胞均有增殖抑制作用，中药汤剂KX的抑制作用随着抽血时间的延长而递减，其中0.5h抽血点各浓度药物血清的抑制作用明显较2h强(P<0.05);中成药片剂BJ药物血清的抑制效果则相反，存在2h比1h强的趋势;在同一采血时间点或不同采血时间点上比较，2种药物血清的抑制效果存在不同，甚至相反。研究表明，不同药物在体内的代谢时间不同，在采用人来源药物血清实验时需要注意，选取对照药时应选取2种药物作用都较强的时候进行比较，切实反映药物疗效。本实验由于未设0.5hBJ，在以后的实验中我们将做进一步完善。

［1］ 叶永安，朱陵群.中药复方血清药理学在中医药研究中应用的思考［J］.中国中医基础医学杂志，2001，7(5):323-324.

［2］ 李仪奎.中药血清药理学实验方法的若干问题［J］.中药新药与临床药理，1999，10(2):95-98.

［3］ 吴健宇，穆静，李仪奎.血清药理实验中异种动物血清对细胞的毒性作用和灭活后的减毒作用［J］.中国药理学通报，2000，16(1):118-119.