东北鹤虱水提取物对小鼠脾淋巴细胞体外增殖、分泌IL-2和TNF-α的作用

于 跃，杨 柳，郭秀英，高建华，孟 林

（天津医科大学药理学教研室，天津 300070）

东北鹤虱 (Lappula Echinata Gilib，LEG)为紫草科一年生草本植物东北鹤虱果实，盛产于我国华北、东北等地区。其性味苦、辛、平，入脾、胃、肝三经，具有驱虫、抗炎、抗腹泻的作用，可治疗虫积腹痛[1]。民间用其果实或全草水煎治疗各种腹泻，尤其对慢性腹泻、老年性腹泻、某些疾病如糖尿病、肿瘤等伴发的腹泻有明显作用。已有研究证明其水提取物具有抗炎[2]、缓解平滑肌痉挛[3]、调节胃肠水平衡[4]等作用，但未见LEG-I对机体免疫系统作用的报道。本文通过观察脾淋巴细胞增殖、细胞周期变化、细胞因子IL-2和TNF-α分泌，探讨LEG-I对机体免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 LEG，产地为我国黑龙江省，种子类药材，呈卵形，长约3～3.5mm，由黑龙江中医药大学药学院药用植物学教研室于嘉彬教授鉴定。取干燥的LEG，粉碎至20目，水煎煮，过滤除药渣后合并药液，以水提醇沉法及Sevag法收集并除蛋白，所得提取物过滤，经减压旋蒸，透析，最后冷冻干燥，得到粉末状淡黄色提取物LEG-I，-20℃保存。临用前LEG-I用PBS缓冲液配制成1mg/ml储备液，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，可4℃保存，实验中再以PBS缓冲液稀释成所需浓度。

1.1.2 试剂 ConAⅣ型，美国Sigma公司；四甲基偶氮唑盐（Methyl thiazolyl tetrazole,MTT），瑞士 Fluka公司；二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide,DMSO），美国Amresco公司；Mouse IL-2测定试剂盒，晶美生物工程有限公司，生产批号20071125；碘化丙啶染料，美国Sigma公司；核糖核酸酶A（Ribonuclease A,RNaseA），美国 Sigma 公司；胰蛋白酶，Gibco，批号：200706321；放线菌素D，美国Sigma公司。

1.1.3 实验动物及细胞 近交系清洁级BALB/C小鼠，体重（20±0.25）g，4～5 周龄，雌雄不拘，购自中国医学科学院放射医学研究所（批准文号：SCXK津2005-0001）。L929细胞株由天津医科大学药学院惠赠，常规复苏传代，应用时调整至所需浓度。

1.1.4 仪器 Model680型酶标仪（Bio-Rad）；Epics-XL型流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）。

1.2 方法

1.2.1 对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 取BALB/C小鼠1只，无菌条件下常规方法制备脾细胞悬液。台盼蓝测定细胞存活率为90%以上，细胞计数，RPMI-1640培养基调整细胞浓度为2×106/m l。取悬液加入96孔细胞培养板中，每孔160μl。实验分为对照组（每孔加入20μl RPMI-1640培养液）、药物单独刺激组（每孔加入20μl LEG-I，其终浓度为3.125～100μg/ml）、ConA单独刺激组（每孔加入 20μl ConA，使其终浓度为5μg/ml）以及药物协同ConA刺激组（每孔加入20μl LEG-I，其终浓度为0.781～100μg/ml和 20μl ConA，其终浓度为 5μg/ml），各孔用RPMI-1640培养液补足体积至200μl。每组每浓度做6复孔。于37℃，5%CO2孵箱中培养68 h，取出培养板每孔加20μl5mg/ml的MTT溶液，放于孵箱中继续培养4 h，取出后将孔板离心1 500 r/min 15min，小心吸弃上清，每孔加入100μlDMSO，振荡5min，于酶标仪上测OD570nm值，并计算淋巴细胞转化刺激指数 （stimulation index，SI），SI=实验孔OD570nm值/对照孔OD570nm值。

1.2.2 对小鼠脾淋巴细胞周期分布的影响 按上述方法制备小鼠脾淋巴细胞，调整细胞浓度为2×106/ml，细胞加入 24 孔板中，每孔 0.8ml，空白组补加RPMI-1640培养液0.2ml，实验组加入不同浓度的 LEG-I0.2ml使其终浓度为（100 μg/m l），ConA组加入0.2mlConA使其终浓度为5μg/m l，于37℃，5%CO2孵箱中培养48 h，收获细胞至离心管内。将收集细胞离心1 000 r/min，5min，弃去上清，冷PBS洗细胞两次，离心1 000 r/min，5min。70%乙醇4℃固定过夜，上机前，离心收集细胞，并用PBS洗细胞，弃上清，加入500μlRNaseA（终浓度为100μl/m l），37 ℃作用30min，再加入50μl/ml碘化丙啶染液500μl室温避光染色30min，吹散细胞后用300目尼龙滤膜过滤，然后以流式细胞仪分析细胞周期，每个样品收集10 000个细胞的参数，分析结果以处于G0/G1期、S期、G2/M期细胞的百分率表示，根据公式PI=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100%计算增殖指数（proliferation index,PI）。

1.2.3 对小鼠脾淋巴细胞分泌TNF-α的影响 无菌收集小鼠脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度至2×106/ml，于96孔板中，每孔加入160μl细胞悬液，药物单独刺激组加入20μl不同浓度LEG-I（25、50、100μg/ml），ConA协同刺激组每孔除加入上述不同浓度的LEG-I外，各孔还需加入20μlConA（终浓度为5μg/ml），阳性对照组加入终浓度为5μg/ml的ConA 20μl，空白组加入20μlRPMI-1640培养液，各孔加入RPMI-1640液补足体积至200μl。每组平行作6孔重复。于37℃，5%CO2孵箱中培养48 h，1 500 r/min离心10min，收集上清，-20℃冻存。0.25%胰蛋白酶消化对数生长期的TNF敏感的鼠成纤维细胞系L929细胞2min后，加入RPMI-1640完全培养基终止消化，收集细胞，用RPMI-1640培养液洗两次，调整细胞浓度为1×105/ml，加入96孔板中（每孔100μl），孵箱过夜。弃上清，加入脾细胞培养上清100μl和20μl放线菌素D（终浓度为1mg/L），培养20 h。于倒置显微镜下，观察细胞杀伤情况。以MTT法测定杀伤细胞的细胞毒活力。

1.2.4 对小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2的影响 脾淋巴细胞悬液制备及分组方法同上，各实验组给药浓度分别为 6.25、25、100 μg/m l。细胞于 37 ℃，5%CO2孵箱中培养48 h，1 500 r/min离心10min，收集上清，-20℃冻存。标本中IL-2含量测定按试剂盒说明书步骤进行。结果判断：每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值。以标准品浓度作横坐标，OD450nm值作纵坐标，应用统计软件SPSS15.0绘制标准曲线，据曲线函数值计算个标本的浓度值。

1.3 统计学方法 实验数据应用SPSS15.0统计软件进行处理，结果均以表示。多样本均数比较进行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析（ONEWAY ANOVA），方差齐者采用LSD法检验，方差不齐采用Dunnett’s T3法检验。

2 结果

2.1 对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 在脾细胞培养液中加入不同浓度的LEG-I作用72 h后，LEG-I在体外有直接激活静止小鼠脾细胞增殖的作用，其OD570nm和SI值明显高于空白对照组，差异具有统计学意义。LEG-I在剂量为3.125～100μg/ml范围内表现为丝裂原特性，并且有剂量依赖关系，其中100μg/ml LEG-I作用于静止小鼠脾淋巴细胞后，其刺激指数SI值与ConA组相当，淋巴细胞增殖率约为83.3%。见表1。

表1 LEG-I对静止小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响(,n=6)

表1 LEG-I对静止小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响(,n=6)

与空白对照组相比*P<0.05,**P<0.01;与ConA单独刺激组相比，#P<0.01

OD570nm 0.215±0.002 0.413±0.012**0.223±0.004*#0.262±0.007**#0.300±0.004**#0.310±0.005**#0.335±0.006**#0.394±0.018**浓度 (μg/m l)5.000 3.125 6.250 12.500 25.000 50.000 100.000 SI 1.000±0.012 1.919±0.055**1.037±0.017*#1.220±0.034**#1.395±0.022**#1.440±0.024**#1.559±0.028**#1.833±0.081**组别空白对照组ConA单独刺激组LEG-I单独刺激组

表2显示，不同浓度LEG-I对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应具有明显的促进作用，与ConA组相比，其OD570nm和SI值明显升高，差异有统计学意义。其中100μg/ml LEG-I作用于活化的小鼠脾淋巴细胞后，淋巴细胞增殖率约为276.4%。说明LEG-I与ConA具有协同刺激作用。

表2 LEG-I对被ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响(,n=6)

表2 LEG-I对被ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响(,n=6)

与空白对照组相比*P<0.01;与ConA单独刺激组相比#P<0.05,##P<0.01

组别空白对照组ConA单独刺激组LEG-I协同ConA OD570nm 0.219±0.011 0.467±0.024*0.524±0.016*#0.532±0.007*#0.539±0.005*#0.575±0.029*##0.713±0.044*##0.722±0.042*##0.732±0.025*##0.826±0.035*##浓度 (μg/m l)5.000 0.781 1.562 3.125 6.250 12.500 25.000 50.000 100.000 SI 1.000±0.053 2.131±0.110*2.388±0.072*#2.429±0.033*#2.455±0.024*#2.620±0.134*##3.251±0.199*##3.291±0.193*##3.339±0.114*##3.764±0.162*##

2.2 对小鼠脾淋巴细胞周期分布的影响 未刺激的对照组淋巴细胞多处于G0/G1期，其增殖指数PI为14.60%，经ConA刺激48 h后，与对照组相比，G0/G1期细胞数减少，分裂期的细胞明显增加，增殖指数PI为28.90%，明显高于对照组（图1）；经LEG-I作用48 h后，进入S期和G2/M期的小鼠脾淋巴细胞分别为16.00%和7.90%，增殖指数（23.90%）高于空白对照组。说明LEG-I可促进淋巴细胞DNA的合成，使细胞进入分裂期。

2.3 对小鼠脾淋巴细胞分泌TNF-α的影响 L929细胞是一类对TNF-α敏感的细胞株，L929细胞抑制率越高，表明小鼠脾淋巴细胞分泌TNF-α量越多。单独给与LEG-I后，与对照组相比，25、50及100μg/ml LEG-I均不能增加对L929细胞抑制率（P>0.05）（图2），说明3组不同剂量LEG-I均不能有效促进小鼠脾淋巴细胞产生TNF-α。

LEG-I与ConA协同刺激后，与ConA组相比，3组不同剂量LEG-I均可增加L929细胞抑制率，如图3A可以看出，100μg/ml LEG-I与ConA协同刺激小鼠脾淋巴细胞48 h，其上清液作用于L929细胞20 h后，倒置显微镜下观察细胞体积缩小，胞浆浓缩，折光性差。而空白组（如图3B）L929细胞呈多角形生长，胞质均匀，折光性强。这一结果表明，LEG-I可增加ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞TNF-α分泌，并且具有一定的剂量依赖性。

2.4 对小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2的影响 表3显示，小鼠脾淋巴细胞可自发性分泌一定量水平的IL-2，加入不同浓度LEG-I后，对静止的小鼠脾细胞上清中IL-2的分泌无明显增加作用，与空白对照组相比无统计学差异（P>0.05）。经过ConA刺激后，小鼠脾细胞分泌IL-2明显升高，与空白对照组相比，有显著性差异。3个剂量组LEG-I均可提高ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞IL-2分泌水平，与ConA组相比，其增长率分别为3.39%、22.75%、34.42%。并且在6.25～100μg/ml范围内，其刺激作用具有浓度依赖性，随LEG-I浓度升高，IL-2分泌水平提高。

回归方程：(A vsC)C=422.37×A-84.731，r=0.995 5

表3 LEG-I对静止和ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2的影响( ,n=6)

表3 LEG-I对静止和ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2的影响( ,n=6)

与空白对照组相比*P<0.01；与ConA单独刺激组相比#P<0.05，##P<0.01

IL-2(pg/m l)23.28±3.26 175.16±6.54*26.17±4.21 25.88±4.21 26.83±3.07 181.10±1.37*#215.01±6.30*##235.45±3.24*##浓度(μg/ml)5.00 6.25 25.00 100.00 6.25 25.00 100.00组别空白对照组ConA单独刺激组LEG-I单独刺激组LEG-I+ConA协同组

3 讨论

本实验研究了LEG-I对小鼠脾淋巴细胞增殖及对TNF-α和IL-2分泌的影响。实验中，LEG-I可有效刺激小鼠脾淋巴细胞增殖,在3.125～100μg/ml浓度范围内呈剂量依赖效应。由此提示，LEG-I可能是淋巴细胞的致有丝分裂原或具有丝裂原样作用，可直接启动淋巴细胞表面受体活化，促进脾淋巴细胞增殖，提高机体的免疫能力。ConA是常用的诱导T细胞发生增殖的有丝分裂原[5]，LEG-I能增强淋巴细胞对刺激物ConA的反应性，在0.781～100μg/ml剂量范围内具有剂量依赖关系，说明LEG-I与有丝分裂原具有协同刺激脾淋巴细胞增殖作用。

正常小鼠淋巴细胞在未接受抗原刺激时多处于G0期[6]，给药组小鼠脾淋巴细胞较空白组G0/G1期细胞比例降低，而S期和G2/M期细胞比例增加，提示LEG-I主要作用于小鼠脾淋巴细胞细胞周期的S期和M期，促进淋巴细胞DNA合成，使细胞从G0/G1期进入S期，通过调节细胞周期诱导小鼠脾淋巴细胞进入分裂增殖期。

正常小鼠脾淋巴细胞可分泌一定生理水平的TNF-α，LEG-I对正常小鼠脾淋巴细胞TNF-α的产生几乎无影响，但可增加脾细胞在ConA刺激后产生TNF-α的量，生成的TNF-α可能参与巨噬细胞活化，诱生多种免疫调节介质，如IL-1、IL-6、CSF等，刺激T细胞增殖，增强NK活性，调节B细胞分化、增殖等[7-8]。LEG-I有可能通过上述途径实现其免疫调节作用。

类似的结果也出现于此，LEG-I对静止期淋巴细胞IL-2分泌无调节作用，却显著增加ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞IL-2分泌水平，在6.25～100μg/ml剂量范围内呈剂量依赖性。IL-2是T淋巴细胞的自分泌或旁分泌生长因子，可作用于自身或邻近T细胞表面的IL-2受体，诱导淋巴细胞增殖活化，活化的T淋巴细胞可进一步提高机体IL-2水平，形成正反馈效应，从而增强细胞免疫应答，提高机体免疫能力。故LEG-I增强小鼠T淋巴细胞转化功能，推测可能与其促进IL-2产生有关。

综上，LEG-I能促进静息状态及ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖，促进淋巴细胞DNA合成，使细胞进入分裂增殖期，促进ConA活化小鼠脾淋巴细胞TNF-α及IL-2分泌，表明LEG-I具有免疫激活或免疫增强作用。

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