HPLC测定不同生长期及不同部位委陵菜中委陵菜黄酮的含量

黄颖瑜，唐生安，胡 玮，段宏泉

（天津医科大学药学院，基础医学研究中心，天津 300070）

中药委陵菜（Potentilla chinesis Ser.）又名白头翁，蛤蟆草，为蔷薇科植物委陵菜属委陵菜的干燥全草。委陵菜性寒，味苦，具有清热解毒，凉血止痢的作用[1]。研究证明其提取物具有抗糖尿病[2]，抗菌抗病毒[3-4]，保肝[5]及镇痛[6]的作用。经临床应用调查，在天津蓟县中医医院和天津中医药大学附属医院应用于治疗糖尿病，取得了较好的疗效。本实验室在研究委陵菜抗糖尿病活性成分中得到一黄酮类主要有效成分-委陵菜黄酮，药效学考察表明委陵菜黄酮抗糖尿病作用与二甲双胍相当，是中药委陵菜抗糖尿病作用的主要有效成分[7-8]。本试验采集天津蓟县地区不同生长时期的委陵菜，建立高效液相色谱法测定药材中委陵菜黄酮的含量，同时研究有效成分委陵菜黄酮在不同生长期和不同部位药材中的含量变化，为委陵菜质量标准的进一步提高提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与药材 岛津LC-6A高效液相色谱仪（日本岛津），分析之星色谱工作站；十万分之一电子分析天平（赛多利斯科仪器北京有限公司），电热恒温水浴锅（北京科伟永鑫实验设备厂），KQ-500B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；委陵菜黄酮对照品：为本实验室自制，经1H-NMR及13C-NMR和MS鉴定结构，HPLC峰面积归一化法测定其纯度为99.713%，甲醇（色谱纯，天津基准化学试剂有限公司），水（超纯水），其他试剂均为分析纯。

委陵菜，2008年采自天津蓟县，经天津医科大学药学院生药学教研室鉴定。

1.2 色谱条件 KromasilC18色谱柱（4.6mm×250mm,5μm,TIANHE)，甲醇-3‰冰醋酸水溶液（49:51）为流动相，流速：1ml·min-1，检测波长：254 nm，柱温：30 ℃，进样量：20 μl。

1.3 溶液制备

1.3.1 对照品溶液的制备 精密称取委陵菜黄酮对照品2.500mg，置于25ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，使其浓度为 100μg·ml-1，摇匀，作为委陵菜黄酮对照品的储备液。

1.3.2 供试品溶液的制备 精密称取药材粉末3.00 g，置于索氏提取器中，加甲醇100ml，回流提取4 h，回收甲醇提取液，浓缩，过滤，定容至50ml，备用。

1.4 方法学考察

1.4.1 线性关系考察 精密吸取对照品溶液0.5、1.5、3、6、8 至 10ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀得 5、15、30、60、80 μg·ml-1对照品溶液，备用。以上各对照品溶液进样20μl，按照“1.2”项下色谱条件测定峰面积，以浓度（μg/ml）为横坐标，以峰面积为纵坐标进行线性回归，回归方程为Y=58 560X+14 239,r=0.999 9，表明委陵菜黄酮在5~150μg·ml-1浓度范围内呈现良好的线性关系。

1.4.2 精密度考察 对照品溶液连续进样6次，测定峰面积，计算RSD为0.78%。

1.4.3 重复性试验 按照“1.3.2”项下方法制备供试品溶液5份，对照品和供试品溶液各进样20μl，测得峰面积，计算得药材中委陵菜黄酮的含量平均值为1.007‰，RSD为2.25%。

1.4.4 稳定性试验 取供试品溶液分别在0、2、4、8、12、24 h进样，测定峰面积，计算RSD为2.88%。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

1.4.5 加样回收率试验 精密称取委陵菜药材粉末3.0 g共9份，按照药材中委陵菜黄酮含量的80%、100%、120%加入委陵菜黄酮对照品，每个浓度各分别按照“1.3.2”项下方法制备3份供试品溶液，进样测定，结果显示，80%、100%、120%委陵菜黄酮加入量 的 回 收 率 为 99.23%（RSD=1.92%）、101.48%（RSD=0.34%）、102.92%（RSD=0.74%），平均加样回收率为101.21%，RSD为1.76%,符合含量测定方法学要求。

2 样品测定结果

2.1 精密称取不同月份生长的委陵菜药材粉末，按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，进样，测定色谱峰面积，以外标法计算含量，结果见表1。

表1 不同生长期委陵菜药材中委陵菜黄酮的含量（‰）

2.2 精密称取7月份采集的不同部位委陵菜药材粉末3.0 g，按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，进样，测定色谱峰面积，以外标法计算含量，结果见表2。

表2 不同部位生长的委陵菜药材中委陵菜黄酮的含量（‰）

3 讨论

3.1 供试品提取方法的选择 经查阅相关文献以及对委陵菜黄酮理化性质的考察，选择甲醇作为提取溶剂，并取10月份委陵菜分别考察了索氏回流提取、超声提取对委陵菜药材中委陵菜黄酮的提取率，结果显示索式提取测得含量为0.51%，超声提取测得含量为0.32%，表明索氏提取法委陵菜黄酮的提取率更高。

3.2 色谱条件的选择与优化 为了尽可能获得较好的分离效果，对色谱条件进行了优化，考察了不同组成的流动相，如甲醇-水，甲醇-冰醋酸水溶液系统。结果表明冰醋酸可以减少色谱峰的拖尾，使色谱峰达到较高的对称性，改善分离度，最终确定甲醇-3‰冰醋酸水溶液（49:51）为流动相，峰形对称性较好，无拖尾，委陵菜黄酮保留时间为25min左右。

实验结果表明，不同月份以及不同生长部位的委陵菜中委陵菜黄酮的含量存在较大差异，委陵菜黄酮的含量随着生长时间的增加而增加，到7月份含量最高，8月份以后含量逐渐降低，而同一植株中委陵菜黄酮在叶部位含量最高，根含量最低，两者含量差异达9倍多。国家药典2005年版规定委陵菜于春季末抽茎时采挖，较有效成分委陵菜黄酮含量最高的7月份提前1~2个月，本文的实验结果为用于糖尿病治疗的委陵菜药材采集和质量控制标准制定提供了依据。

[1]卫生部药典委员会.中华人民共和国药典,一部[S].北京：化学工业出版社，2005：149

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[4]张巧玲，杨占秋，陈科力.4种药用植物提取物体外抗柯萨奇病毒 B3作用的研究[J].武汉大学学报（医学版），2005，26（2）：187

[5]李贞，张铁汉，叶亮，等.委陵菜对四氯化碳致小鼠肝损伤保护作用[J].时珍国医国药，2001，12（4）：294

[6]边可君，徐碧辉，黄开勋，等.三叶委陵菜乙醇提取物镇痛作用的研究[J].江苏临床医学杂志，2002，6（3）：200

[7]赵川，乔卫，张彦文，等.委陵菜抗糖尿病有效部位及有效成分的研究[J].中国中药杂志，2008，6（33）：680

[8]段宏泉，刘普，乔卫，等.委陵菜黄酮化合物提取分离方法和应用[P].中国发明专利：ZL200610015591.5