天津地区IL-1Ra基因内含子2可变串联重复序列与脓毒症的相关性研究

杨 群，魏殿军，何 屏，王巍巍，门 昆

（天津医科大学第二医院检验科，天津 300211）

白细胞介素-1(IL-1)是近年来研究比较多的前炎症细胞因子，在炎症反应和免疫应答中具有调节作用，生物作用广泛[1]。白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1Ra）是IL-1家族的唯一一种天然拮抗剂，其结构与IL-1相似,通过与Ⅰ型IL-1受体竞争结合而阻止IL-1效应的发挥，已有许多学者关注其基因多态性与疾病的关系。编码IL-1Ra的基因定位于人类染色体的2q12-13上，该基因的第2号内含子存在可变串联重复序列（VNTR）多态性，可能影响IL-1Ra的表达，并与许多慢性炎症性疾病和自身免疫性疾病的发生发展密切相关[2]。IL-1Ra VNTR重复序列长86bp。以往的研究根据重复序列出现的次数不同发现5种等位基因：IL-1RNⅠ（4个重复体，410bp）、IL-1RNⅡ（2 个重复体，240bp）、IL-1RN III（5 个重复体 500bp）、IL-1RN IV（3 个重复体，325bp）和 IL-1RN V（6 个重复体，595bp），其中 III、IV、V 等位基因的发生频率极低。国外有人报道该基因可变区的基因多态性与脓毒症的保护作用相关，本文采用PCR技术观察IL-1Ra基因多态性与脓毒症的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

1.1.1 病例组 来自天津市第一中心医院、天津医科大学第二医院ICU病房脓毒症病人90例，其中男60例，女 30例，平均年龄（53±15）岁，所有病例的诊断均符合1991年美国胸科医师协会（ACCP）和危重病医学会（SCCM）联席会议的诊断标准[3]。

1.1.2 对照组 随机选取健康查体人群120例，男65例，女 55例，平均年龄（56±12）岁，且血常规、生化指标均在参考范围内,排除肝脏、肾脏、内分泌和心血管疾病。所有研究对象均为汉族自然人群,且无血缘关系。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 抽取静脉血2 ml，用EDTA-K3抗凝，采用经典的酚氯仿法提取基因组DNA。于-20℃保存。

1.2.2 引物合成 参照文献[4]设计合成一对引物,扩增IL-1Ra基因第2号内含子中包含VNTR的一段序列。上游序列为：5′-CTCAGCAACACTCCTAT-3′，下游序列为：5′-TCCTGGTCTGCAGGTAA-3′（上海英俊公司合成）。

1.2.3 PCR PCR扩增条件为25μl的体系中含有premix taq 12.5μl，上游引物0.5μl（50 pmol/L），下游引物0.5μl（50 pmol/L），模板DNA 3μl，ddH2O 8.5μl。PCR扩增循环参数为95℃预变性5min→95℃变性40 s→55℃复性45 s→72℃延伸50 s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存,以上反应均在基因扩增仪（Long Gene公司产品）上完成。

1.2.4 基因分型 PCR扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳Goldview染色法检测，以DL1000(大连宝生物生物工程有限公司产品)为DNA片段标准物,在紫外线下观察结果并照相。将其中一个产物测序，结果表明引物序列及产物大小均与原设计相同。

1.3 统计学分析 根据电泳结果得出两组人群IL-1Ra的等位基因型别，某种等位基因在相应人群中的百分数为其基因频率，经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验。病例组与对照组间各等位基因及基因型频率的比较用SPSS11.0统计软件进行χ2检验,以P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 检测结果 我们在两组人群中共发现IL-1RNⅠ/Ⅰ、IL-1RNⅠ/Ⅱ和IL-1RNⅠ/Ⅳ共3种基因型，未扩增出IL-1RNⅣ和IL-1RNⅤ型（图1）。

2.2 脓毒症组和对照组IL-1Ra VNTR的分布 基因型及等位基因频率在两组人群中的分布（表1）均符合Hardy-Weinberg遗传平衡,表明其基因频率已达到遗传平衡,在两组人群中具有群体代表性。基因型分布均以IL-1RNⅠ/Ⅰ型最为常见,等位基因的分布以Ⅰ型最为常见,其次为Ⅱ型,Ⅳ型较为罕见,未发现Ⅲ型和Ⅴ型。

2.3 IL-1Ra VNTR与发生脓毒症风险性的关系 在表1中,对照组IL-1RNⅠ/Ⅱ基因型与脓毒症组相比有较高的分布频率(P<0.05)，且Ⅱ型等位基因在对照组也显著增加（P<0.05），不携带Ⅱ型等位基因的基因型(Ⅰ/Ⅰ和Ⅰ/Ⅳ）和非Ⅱ型等位基因携带者（Ⅰ，Ⅳ）与携带Ⅱ型等位基因的基因型（Ⅰ/Ⅱ）和Ⅱ型等位基因携带者相比发生脓毒症的相对危险度分别为4.3和4.0,这提示Ⅱ型等位基因在脓毒症的发生和发展过程中可能具有保护作用。

表1 IL-1RN基因型和等位基因的分布频率[n(%)]

3 讨论

脓毒症是因感染引起的全身性炎症反应，仍然是目前ICU病人死亡常见原因[5]，且不同患者表现出高度的差异，易感人群很容易发生炎症反应失控，迅速进入脓毒症状态，提示这可能与某些特异性基因的存在或基因表达特性发生改变有关[6]。近年来,通过对临床脓毒症的炎症相关因子的基因型相关分析,已经发现TNF、IL-1家族、IL-10等炎症因子的相关表达基因，均存在脓毒症相关的基因多态性[7]。Tomita等[8]研究表明IL-1RNⅡ携带者血浆中的IL-1Ra浓度较高,且IL-1RNⅡ携带者的单核细胞在体外LPS刺激后产IL-1Ra的浓度较高，因其与IL-1具有很大的相似性，故可以与IL-1受体竞争性结合，产生拮抗IL-1的多种生物学效应，从而减轻炎症反应的发生发展，这可能使其在许多由IL-1介导的疾病中发挥潜在的保护作用。Arnalich[9]分析了78例严重脓毒症病人(其中27例死亡)及130个健康对照者的基因型,多重回归分析发现不携带IL-1RNⅡ的脓毒症病人死亡的危险性增加6.47倍。李艳等[10]研究发现不携带IL-1RNⅡ型等位基因的患者发生冠心病的风险比携带此基因的健康对照组提高了将近2倍，均提示IL-1RN基因多态性可能在炎症及其感染的发病过程中有潜在作用。

在IL-1RaVNTR核心序列中含有3个蛋白质结合位点,这种结构特点提示该VNTR多态性对其编码的蛋白质产生可能造成影响。有资料表明,Ⅱ型等位基因与血浆中IL-1Ra的高表达相关。我们的研究中两组共出现了3种等位基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ，且以Ⅰ型为主，这基本上与南美黑人的一致。另外，不携带Ⅱ型等位基因的基因型（Ⅰ/Ⅰ和Ⅰ/Ⅳ）和非Ⅱ型等位基因携带者（Ⅰ，Ⅳ）与携带Ⅱ型等位基因的基因型（Ⅰ/Ⅱ）和Ⅱ型等位基因携带者相比发生脓毒症的相对危险度分别为4.3和4.0。这提示Ⅱ型等位基因在脓毒症的发生和发展过程中可能具有保护作用。

总之，我们的研究发现IL-1Ra VNTR多态性与脓毒症的发生、发展及该疾病的严重程度有相关性,Ⅱ型等位基因可能具有保护作用,同时也提示了炎症反应在脓毒症的发生和发展过程中起着积极的促进作用。上述结果为进一步研究脓毒症的发病机制、预防和治疗奠定了一定的理论基础。

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[9]Arnalich F,LopezMaderuelo D,Codoceo R.IL-1receptor antagonistgene polymorphism andmortality in patientswith severe sepsis[J].Clin Exp Immunol,2002,127(2):331

[10]李艳，徐朴，张平安,等.白细胞介素1受体拮抗剂基因内含子2串联可变重复序列多态性与冠心病的相关性[J].中国动脉硬化杂志，2003，11(5):451