构建用慢病毒载体介导的RNAi敲除ABCG2的Caco-2细胞模型

李伟霞，李咏梅，李光明，杜文才，张 斌，程 彬，朱 泽

（天津医科大学病原生物学教研室，天津 300070）

Caco-2（the human colon carcinoma cell line）是一种人类结肠癌细胞系，近十几年来Caco-2细胞作为一种口服药物肠吸收的体外模型而被广泛应用[1-2]；其胞膜上ABCG2（the ATP-binding cassette transporter family G member 2）又称乳腺癌耐药蛋白（breastcancer resistance protein,BCRP），是一种跨膜转运蛋白，定位于肠上皮细胞的绒毛膜面，其功能是将进入肠上皮细胞内的药物或化合物外排，减少其在肠道的吸收，并导致如托泊替康、SN-38等多种抗肿瘤药物耐药，以及其它化合物或营养物质的低生物利用度。如何逆转ABCG2介导的外排转运作用，是当前国内外研究的重点和热点。RNA interference(RNAi)是高效的特异性强的抑制基因表达的基因沉默技术。本研究中，我们设计合成了靶向ABCG2的shRNA，用表达shRNA的重组慢病毒感染Caco-2 TC7细胞，希望能够用慢病毒载体介导的RNAi成功构建持久、稳定敲除ABCG2蛋白的Caco-2细胞模型。

1 材料与方法

1.1 材料 Caco-2 TC7细胞由美国University of Houston胡明教授惠赠；DMEM培养基、胎牛血清购自Hyclone公司；HEPES、D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸购自Sigma公司；Lipofectamine 2000和Trizol购自 Invitrogen公司；T4 DNA连接酶、Bam HⅠ和XhoⅠ限制性内切酶、SYBR green PCR kit、Premix Tag和RT-PCR kit购自大连宝生物工程有限公司；质粒pVSVG、pCMV和pRNAT-u6.2由上海比昂生物医药科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 Caco-2 TC7细胞是Caco-2的亚克隆细胞，于含有HEPES、D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、抗生素和10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。Caco-2 TC7细胞隔天换液，当细胞生长至95%融合时，用含EDTA的PBS平衡盐溶液漂洗并用胰蛋白酶消化传代。293T细胞、Hela细胞用含10%胎牛血清和100mg/ml链霉素及100U/ml青霉素的DMEM培养基培养。其培养均在37℃、5%CO2条件下进行。

1.2.2 慢病毒载体的构建

1.2.2.1 shRNA寡核苷酸链的设计合成和质粒载体的构建：根据人源ABCG2mRNA序列（NM_004827）选择该基因 cDNA 序列的 829～850、1378～1399、1462～1483、1193～1212作为4个靶位点，依次命名为 sh1～sh4（表 1），用软件 BLOCK-iTMRNAiDesigner设计合成相应的互补的shRNA寡核苷酸单链，同时设计合成一对不靶向ABCG2基因的shRNA寡核苷酸单链shRNA/Negative作为对照。shRNA包含酶切位点（Bam HⅠ）、针对靶位点的干扰序列、loop环、干扰序列的反向互补序列、中止信号（TTTTTTCCAA）和酶切位点（XhoⅠ）。互补的shRNA寡核苷酸单链经退火形成双链，Bam HⅠ和XhoⅠ酶切表达GFP荧光的质粒pRNAT-u6.2，用T4DNA连接酶连接退火形成的双链与酶切后的质粒载体，分别构建成pRNAT-u6.2/Negative,pRNAT-u6.2/ABCG2-sh1,pRNAT-u6.2/ABCG2-sh2,pRNAT-u6.2/ABCG2-sh3和pRNAT-u6.2/ABCG2-sh4质粒载体。

表1 ABCG2的靶序列

1.2.2.2 慢病毒载体的包装和滴度测定：用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以0.5×106/ml的细胞密度，接种于15 cm细胞培养皿，37℃，5%CO2培养箱内培养，细胞密度达60%～70%时转染。转染前1 d将细胞培养液更换为不含抗生素的培养液。用无血清DMEM制备三质粒DNA溶液：15μg包膜质粒pVSVG、20μg包装质粒pCMV和30μg转染质粒pRNAT-u6.2/ABCG2-sh 或 pRNAT-u6.2/Negative，按照Lipofectamine 2000操作步骤将三质粒DNA溶液转染293T细胞，于37℃，5%CO2培养箱中孵育6 h后吸除含有转染混和物的培养液，加入PBS液漂洗，然后加入含10%血清的完全培养液15ml，培养箱内继续培养48 h，收集293T细胞上清液。于4℃，4 000 r/min离心10min，以0.45μm滤器过滤后置于40ml超速离心管中，4℃、25 000 r/min离心120min；然后以预冷的PBS液重悬病毒沉淀，于4℃溶解过夜即得到病毒液Lv-ABCG2-sh1～sh4。同法获得阴性对照病毒液Lv-Negative-sh。次日，以10μl每管分装病毒液置于-70℃冰箱中保存。

接种Hela细胞于 6孔板，5×104个细胞/孔，培养24 h后，用倍比稀释的病毒液感染Hela细胞，于37°C，5%CO2培养箱培养12 h后，用完全培养液代替病毒感染液继续培养。感染第5天，提取Hela细胞基因组DNA，按照premix Ex TagTM(perfect real time)试剂盒，用real-time PCR检测前病毒DNA的WPRE序列来测定病毒滴度（the transducing units titer TU/ml）。real-time PCR反应条件如下：50℃2 min；95 °C 15min；95 °C 15 s，60 °C 1min，40 个循环，β-actin作为内参对照。WPRE、β-actin引物和探针序列见表2。

1.2.3 慢病毒感染Caco-2细胞 接种Caco-2细胞于3个6孔板，每孔2.5×105个细胞，实验分阴性对照慢病毒Lv-Negative-sh和干扰慢病毒Lv-ABCG2-sh1～sh4共5组，每组3孔细胞。培养3 d后，根据病毒滴度，取适量体积的病毒原液，使病毒的感染复数（multiplicity of infection，MOI）为 3，将病毒原液和培养液混合后加到细胞上，每孔加入1.5ml混合后的病毒液与终浓度为10μg/ml的Polybrene。轻轻晃动培养板混匀。37℃，5%CO2培养24 h后吸掉病毒液，换上完全培养液继续培养，48 h后在倒置显微镜下观察细胞表达荧光情况，感染第5天，收集细胞，检测ABCG2的mRNA和蛋白的表达。

1.2.4 RT-PCR和real-time PCR检测 用TRIzol试剂提取细胞总RNA，以随机引物为逆转录引物，按照RT-PCR试剂盒合成cDNA并进行PCR扩增,PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析。以cDNA为模板，按照SYBR green PCR kit试剂盒进行realtime PCR检测，real-time PCR反应条件如下：50℃1min；95℃ 10min；95℃ 15 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s，40个循环。β-actin作为内参对照。ABCG2和βactin的PCR引物见表2。

表2 PCR引物序列

1.2.5 Western blotting检测 用细胞裂解液冰上裂解实验组细胞30min，13 000 r/min离心15min，收集上清作为样品,Bradford比色法测定蛋白质浓度。10%分离胶进行SDS-PAGE电泳后，用半干转法将蛋白转移至PVDF膜，100V，2 h。封阻液封闭过夜，TBST洗膜后孵育特异性抗体，1∶1 000稀释的一抗anti-ABCG2（antibody 6D170），1∶5 000 稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗：羊抗鼠IgG（ABCG2）。Tubulin作为内参对照。ECLWestern blotting检测试剂盒（Amersham，UK）显色，暗室曝光显影。

2 结果

2.1 慢病毒载体包装和滴度测定 三质粒系统转染293T细胞24 h后，在荧光显微镜下观察到293T细胞中表达绿色荧光，证实了GFP基因的表达。转染48 h后再观察，发现细胞中荧光强度较转染24 h时有所增强，由此慢病毒载体由293T细胞包装产生。通过用real-time PCR检测前病毒DNA的WPRE序列的表达，测定出病毒滴度分别为：Lv-ABCG2-sh1 1.0×108TU/m l，Lv-ABCG2-sh2 1.2×108TU/ml，Lv-ABCG2-sh3 2.3×108TU/ml，Lv-ABCG2-sh4 1.5×108TU/ml。根据病毒滴度，计算感染每组Caco-2细胞所需病毒原液的体积，使病毒对细胞的感染复数MOI为3。

2.2 慢病毒感染后的Caco-2细胞中ABCG2mRNA和蛋白的表达下调 RT-PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析（图1），以β-actin为内参，和Lv-Negative-sh阴性对照组比较，real-time PCR检测结果显示：Lv-ABCG2-sh1、2、3、4 感染的细胞组 ABCG2 表达量分别下调11%、77%、2%和65%（图2）,其中Lv-ABCG2-sh2具有靶向ABCG2最高的抑制效率。Western blotting分析结果显示，与Lv-Negative-sh阴性对照组相比，重组慢病毒载体Lv-ABCG2-sh1、2、3、4能够在蛋白水平抑制ABCG2的表达（图3），而且该基因在蛋白水平的下调趋势与在mRNA水平的变化趋势一致。

2.3 慢病毒感染后的Caco-2细胞的荧光表达 慢病毒感染48 h后，倒置显微镜下可见Lv-Negativesh阴性对照组和Lv-ABCG2-sh1～sh4组的几乎所有Caco-2细胞都表达荧光，并且各组之间没有明显区别，说明几乎所有Caco-2细胞都成功感染了重组的慢病毒载体。对照组Lv-Negative-sh和实验组Lv-ABCG2-sh2荧光图片见图4。

2.4 敲除ABCG2的Caco-2细胞模型的构建 选取靶向ABCG2最高抑制效率的Lv-ABCG2-sh2感染的Caco-2细胞，用real-time PCR监测Caco-2细胞中ABCG2在mRNA水平的表达来检测慢病毒抑制作用的稳定性。检测结果表明，ABCG2的mRNA 23%的表达量可以持续至少15代（图5）。此外，细胞经过多个冻存和复苏循环之后，该基因的mRNA表达水平仍然保持不变。这些结果证明重组慢病毒介导的RNAi能持久、稳定地抑制基因表达。

3 讨论

本研究中我们用重组的4种慢病毒敲除Caco-2细胞的ABCG2，并成功获得持久基因沉默的、稳定低表达ABCG2的Caco-2细胞。本实验中的Lv-ABCG2-sh2感染的Caco-2细胞具有最低的ABCG2表达水平，经验证培养15代仍保持稳定的低ABCG2表达水平，而且经多次冻融后仍保持一致的ABCG2表达水平，说明慢病毒载体介导的RNAi能够达到长期、稳定的沉默效果。先前有报道用化学抑制剂来抑制ABCG2蛋白的功能[3-4]，化学抑制剂的非特异性抑制和对细胞的毒性限制了其应用。随着RNAi技术的发展，又采用化学合成的siRNA[5]、质粒[6]、腺病毒[7]介导 RNAi敲除 ABCG2，然而由于脂质体转染对细胞的毒性、基因沉默的暂时性和宿主细胞的局限性，严重限制了这些RNAi方法的广泛应用。本实验采用的慢病毒载体则克服了这些问题，慢病毒载体能高效转染宿主细胞，包括分裂和未分裂细胞，能将携带的目的DNA整合到宿主基因组上从而实现长期稳定敲除效果。由于化学合成的siRNA、质粒、腺病毒介导RNAi的暂时性，需要多次重复转染才能保证实验持续进行，而用慢病毒载体构建的细胞系则可以长期多次应用，因此慢病毒介导RNAi又是一种经济便捷的RNAi方法。

在构建慢病毒具有较高敲除率方面，我们应用软件BLOCK-iTMRNAi Designer设计合成靶向ABCG2 cDNA 序列（NM_004827）的 829～850、1378～1399、1462～1483、1193～1212 靶位点的 4 对 shRNA序列，构建成相应的4种重组慢病毒，感染Caco-2细胞，4种重组慢病毒的敲除效率各不相同，其中靶向1378～1399位点的慢病毒具有最高的敲除效率77%。由于实验中病毒对细胞的感染复数相同（MOI＝3），这说明干扰效率的不同源于shRNA敲除能力的不同。如何预测shRNA的敲除效率还没有明确的方法[8]，4种重组慢病毒Lv-ABCG2-shRNA敲除效率的不同，可能是由于靶向同一基因的不同靶区域而设计的shRNA序列不同[9]。这与国外一篇报道的结果是一致的[10]，其研究中用靶向ABCG2 cDNA 序 列 （NM_004827） 的 1225～1245、938～958、2007～2027、1403～1423、833～853 靶位点的 5 种重组慢病毒，敲除Caco-2细胞的ABCG2，5种病毒的敲除效率从54%到97%不等，其中靶向1403～1423位点的慢病毒具有最高的敲除效率97%。比较两研究中ABCG2的靶位点的不同敲除效率及最高敲除效率，推测序列1378～1423可能是最佳的敲除ABCG2的靶点范围，这对应用RNAi技术敲除ABCG2的靶点选择具有重要的指导作用。

综上所述，我们应用靶向ABCG2基因的重组慢病毒感染Caco-2细胞，首次成功构建了持久、稳定敲除ABCG2的Caco-2细胞模型。该细胞模型不仅用于体外研究肠道中ABCG2对口服药物化合物吸收的作用，而且对于口服药物的筛选及提高营养物质的口服生物利用度和逆转多药耐药等研究具有重要意义。

[1]Priebsch A,Rompe F,T觟nnies H,et al.Complete reversal of ABCG2-depending atypicalmultidrug resistance by RNA interference in human carcinomacells[J].Oligonucleotides,2006,16(3):263

[2]Lv H,He ZM,Liu XR,etal.Reversal of BCRP-mediated multidrug resistanceby stableexpression ofsmall interfering RNAs[J].JCell Biochem,2007,102(1):75

[3]LiWT,Zhou GY,Song XR,et al.Modulation of BCRPmediated atypical multidrug resistance phenotype by RNA interference[J].Neoplasma,2005,52(3):219

[4]Ee PL,He X,RossDD,etal.Modulation ofbreastcancer resistance protein(BCRP/ABCG2)geneexpression using RNA interference[J].MolCancer Ther,2004,3(12):1577

[5]LiWT,Zhou GY,Wang CL,et al.Modulation of breast cancer resistance proteinmediated atypical multidrug resistance using RNA interference delivered by adenovirus[J].Chin Med J(Engl),2005,118(13):1123

[6]Rabindran SK,RossDD,Doyle LA,etal.Fumitre morgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein[J].Cancer Res,2000,60(1):47

[7]Kruijtzer CMF,Beijnen JH,Rosing H,etal.Increased oralbioavailability of topotecan in combinationwith thebreastcancer resistance protein and p-glycoprotein inhibitor GF120918[J].JClin Oncol,2002,20(13):2943

[8]Schuck S,Manninen A,Honsho M,et al.Generation of single and double knockdowns in polarized epithelial cells by retrovirus-mediated RNA interference[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(14):4912

[9]Brummelkamp TR,Bernards R,Agami R.A system for stable expression ofshort interfering RNAs inmammalian cells[J].Science,2002,296(5567):550

[10]ZhangW,Li J,Allen SM,et al.Silencing the breast cancer resistance protein expression and function in caco-2 cellsusing lentiviral vector-based shorthairpin RNA[J].Drug Metab Dispos,2009,37(4):737