机械刮取法体外培养牛胸主动脉内皮细胞

谭培艺，高卫真，康 毅，焦建杰，娄建石，刘艳霞

（天津医科大学药理学教研室，天津 300070）

血管内皮细胞是位于血管内膜表面的单层扁平细胞，通过产生和分泌许多血管活性物质，在维持血管舒缩、抗凝血及血管构建等方面起重要作用。内皮细胞的体外培养是研究内皮细胞生物学与多种疾病关系的重要方法。牛胸主动脉来源充足、取材经济、操作方便，已成为血管内皮细胞培养的主要材料。以往采用酶消化法[1]分离，消化时间不好把握，步骤冗繁，且容易污染。本实验拟采用机械刮取法分离牛胸主动脉内皮细胞（CTAECs），旨在建立简单、经济、重复性强，适用于大规模实验研究的细胞培养方法，为血管内皮细胞功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 屠宰场检疫合格的成年黄牛，雌雄不限。

1.1.2 试剂 南美胎牛血清购自美国Hyclone公司。DMEM（含葡萄糖5.5mmol/L）液体培养基购自北京天润善达生物科技有限公司。0.25%胰酶-EDTA购自美国Gibco公司。兔抗牛Ⅷ因子抗体及FITC标记的羊抗兔抗体购自北京中杉金桥公司。

1.2 实验方法

1.2.1 CTAECs的分离 刚刚宰杀的成年黄牛，上端从主动脉弓端，下端至膈的主动脉裂孔处，完整分离胸主动脉，用含有庆大霉素（8万U/L）的PBS液4℃无菌保存，6~8 h内可用。操作前将主动脉血管置于消毒托盘中，剪去主动脉外膜附着脂肪，用上述PBS液冲洗3次去除血污后迅速移入超净工作台，纵向剪开血管，将其截成长约8 cm的组织块，分块置于培养皿中，再次用PBS液清洗。用无菌手术刀在每个组织块内表面轻轻刮取若干次，后移入事先装有DMEM完全培养液（含20%胎牛血清，葡萄糖 5.5mmol/L，青霉素 100 U/ml，链霉素 100mg/ml）的培养瓶中。注意刀片在培养液中轻晃几次，使刮取下的细胞与培养液均匀混合。采用“力度梯度标记”法探索刮取力度，第一次获取细胞的过程中，按照刮取力度不同在培养瓶上标记1~10，数字越大力度越大，接种完毕，取1滴细胞悬液在血细胞计数板上进行细胞计数，根据每瓶细胞成活率的不同探索最佳刮取力度，在此后的实验中便可进行批量操作。最后将培养瓶置于37℃，5%CO2的培养箱中进行培养。24 h后更换培养液，去除未贴壁细胞。以后每3 d换液1次，至细胞融合铺满瓶底。

1.2.2 CTAECs的纯化 若培养瓶中见有内皮细胞和平滑肌细胞同时贴壁生长，需对内皮细胞进行纯化，方法如下：倒置相差显微镜（Olympus CK40-F200）下确定平滑肌细胞团的准确位置，标记于瓶底。倒掉瓶内培养液，将尖头吸管探入瓶内，以标记处为中心贴瓶底螺旋形旋转，破坏平滑肌细胞团，PBS液冲洗脱落细胞3次。重新注入DMEM完全培养液，置于37℃，5%CO2的培养箱中继续培养。

1.2.3 CTAECs的传代培养 待细胞生长融合达80%以上时可进行传代。弃去瓶内培养液，PBS液清洗细胞3次，加入0.25%胰酶-EDTA混合消化液铺满瓶底,置于37℃，5%CO2的培养箱中孵育约7min，倒置相差显微镜下观察细胞回缩变圆，开始漂浮移动时加入含血清DMEM完全培养液4~6ml终止消化，用尖头吸管吹打制成细胞悬液。将瓶内培养液收集于离心管内，1 000 r/min，离心5min，弃上清。再重新注入DMEM完全培养液6~10ml，尖头吸管吹打制成细胞悬液，按1∶2或1∶3比例将细胞悬液接种于培养瓶中，补足培养液，置于培养箱中培养。将细胞接种于24孔细胞培养板中，逐日细胞计数，绘制细胞生长曲线。

1.2.4 CTAECs的鉴定 （1）形态学鉴定：利用倒置相差显微镜对原代和传代血管内皮细胞进行常规观察。（2）Ⅷ因子间接免疫荧光检测：将培养在盖玻片上的内皮细胞及对照组血管平滑肌细胞用95%乙醇，5%乙酸固定15min后滴加入兔抗牛第Ⅷ因子抗原诊断血清37℃孵育1 h，或4℃过夜。PBS冲洗，吸干后加FITC标记的羊抗兔IgG血清，37℃孵育30min。PBS冲洗，吸干后滴加9∶1的纯甘油-PBS封片。荧光显微镜检查，内皮细胞可见细胞核周呈黄绿色发亮荧光环。而平滑肌细胞无此荧光环，是为阴性反应。

2 结果

2.1 CTAECs生长曲线 1~3 d细胞数量逐渐增多，4~6 d进入稳定生长期，7~9d进入生长平台期（图1）。

2.2 牛胸主动脉内皮细胞的形态学观察 倒置相差显微镜下，牛胸主动脉内皮细胞呈多角形、短梭形，核仁显著，呈圆形或椭圆形。在接种24 h后贴壁生长，2~3 d有细胞从组织块钻出（图2），10 d左右细胞融合成单层，如“铺路石”样镶嵌排列（图3）。传代细胞生长旺盛，有时可见多核细胞。台盼蓝排除实验证实，活细胞的百分比为93.7%。

2.3 Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定 牛胸主动脉内皮细胞Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色可见细胞呈圆形、梭形或多边形，胞浆内可见黄绿色颗粒，核周密集（图4）。证明培养的细胞为内皮细胞。

3 讨论

内皮细胞形成机体内一个庞大的内分泌组织，其特殊的解剖学部位使内皮细胞能敏感的感知血流、压力、炎症信号以及血液循环中激素水平的变化，通过一系列信号传导过程与邻近及远处的细胞相互联系，对各种应激作出反应，维持机体内外环境的稳定。牛胸主动脉血管取材方便，来源丰富，与人体动脉血管非常相似，并且内表面积大，较人脐静脉可操作性强，是建立内皮细胞体外培养模型的良好材料。

在培养细胞的获取上，现主要有机械法[2]和酶消化法。酶消化法是利用酶液对内皮表面进行消化，收集消化液经离心弃上清等操作获取细胞[3]，此法消化时间不好掌握，步骤冗繁，容易污染。胰蛋白酶消化能力不强,且有细胞毒性；胶原酶虽消化效果好，但价格昂贵，不适合实验室批量应用。本研究经大量实验证明，改良后的机械刮取法，克服了以往刮取法中细胞纯度不够以及酶消化法冗繁昂贵的缺点，是一个行之有效的内皮细胞体外培养方法。刮取法的力度选择是一个难点，刮取力度不够获取的细胞太少，刮取力度过大又会导致平滑肌细胞的混入，因此我们采用“力度梯度标记法”探索刮取力度。第一次获取细胞的过程中，按照刮取力度由轻到重可在培养瓶上标记1~10，数字越大力度越强。或者将探索时的刮取力度分为轻、中、重3个水平，分别标记于细胞培养瓶上，根据每瓶细胞成活率的情况探索出最佳的刮取力度，在此后的实验中便可以此力度作为标准，进行批量操作。每次原代培养可制备10瓶左右细胞，熟练操作后，成活率可达60%以上。实验证明，探索合适刮取力度后，内皮细胞的纯度可达90%，把操作步骤简单化，细胞成活率最大化，大大降低污染概率，使内皮细胞体外批量培养成为可能。但刮取法不可避免偶会混入平滑肌细胞，若发现培养瓶内混有平滑肌细胞团，可在倒置相差显微镜下找到细胞团，用记号笔在瓶身处标记其准确位置，待倒掉瓶内培养液后，将无菌尖头吸管探入瓶内相应位置，以标记点为中心进行螺旋形涂抹，PBS液冲洗3遍去除脱落细胞，重新注入DMEM完全培养液继续培养。此法可有效去除杂细胞，瓶内内皮细胞生长不受影响。

培养液的配置是CTAECs体外培养成功的另一个关键所在[4]。首先，培养基含糖量要求为5.5mmol/L，高低浓度的葡萄糖含量都可以抑制血管内皮细胞的增殖[5]，使细胞出现空泡等不良状态，降低CTAECs的成活率。其次，有实验结果显示，高质量的血清对内皮细胞的生长有良好的促进作用，我们在实验中选用南美血源的胎牛血清，占培养液20%的比例进行培养，极大促进了原代细胞的贴壁和传代细胞的成活率，在不添加内皮细胞生长因子（VEGF）的情况下，可传7~10代，细胞生长状况良好。传代后细胞增殖速度明显加快，此时可将血清比例降为10%对增殖速度进行控制。最后，正确选择传代时机，可提高内皮细胞的成活率，传代过迟造成细胞凋亡；传代过频，引起细胞变异和损伤[6]。

标本材料的新鲜程度也影响获得内皮细胞的数量。有研究表明，动脉血管离体后，随着时间的延长，细胞内一些物质的含量会发生变化。如离体超过6 h，内皮细胞Ⅷ因子相关抗原释放量以及前列环素生长量均随着存放时间的延长而下降[7]。本实验于1 h内完成原代分离培养，细胞数量多增殖速度快。

牛胸主动脉内皮细胞相对于其他血管内皮易分离取得，经济实用。应用改良后的机械刮取法可成功获得大量牛胸主动脉内皮细胞，为体外研究建立血管内皮提供实验模型，为进一步研究血管内皮的生物学特性及其与各种疾病的关系打下基础。

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[5]吕晔，叶希韵.葡萄糖浓度的波动对牛血管内皮细胞的影响[J].华东师范大学学报（自然科学版），2007，52（2）：129

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