毛细管电泳仪在掺假牛乳检测中的应用

宋宏新,刘立新,马瑛东,潘洁

(陕西科技大学生命科学与工程学院,西安710021)

毛细管电泳仪在掺假牛乳检测中的应用

宋宏新,刘立新,马瑛东,潘洁

(陕西科技大学生命科学与工程学院,西安710021)

应用高效毛细管电泳方法对牛乳蛋白、大豆分离蛋白、明胶和乳清蛋白进行检测。选择未涂层的熔融石英毛细管，采用浓度为0.1 mol/L的磷酸盐缓冲体系，在紫外检测波长214 nm，分离电压26 kV条件下测出5种乳蛋白在不同线性范围内的线性相关系数均大于0.997，各乳蛋白的迁移时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)分别小于0.33%和4.65%，牛乳样品加标回收率范围为86%～102%；通过对比大豆分离蛋白、明胶、乳清蛋白及乳蛋白的电泳图谱，定性并定量出不同蛋白质特征峰，方法重现性较好，可以作为牛奶质量的监控快速检测方法。

毛细管电泳；牛乳蛋白；大豆分离蛋白；明胶；乳清粉

0 引言

我国近几年出现的乳制品事件，其核心问题是乳品中蛋白质质量指标，由于恶性非蛋白质氮源掺假，比较容易检测监控，所以乳品掺假物必然会转向更高级的廉价蛋白质掺假，要将这些蛋白质与正常乳源蛋白质区别检验分析的难度要大得多，因此需要探究一种快速、准确的方法来鉴定分析牛乳蛋白。

牛奶中蛋白质的质量分数为3%～3.5%,其中,80%为酪蛋白,20%为乳清蛋白。酪蛋白又分为α-酪蛋白（α-CN）,β-酪蛋白（β-CN）,κ-酪蛋白（κ-CN）。乳清蛋白主要是由β-乳球蛋白(β-Lg)和α-乳白蛋白(α-La)组成[1]。目前常用的牛乳蛋白分析方法有：凯氏定氮法[2]、杜马斯燃烧法[3]、显色比色法[4]、高效液相色谱法[6]、电泳分析[5]等。本文研究了毛细管电泳仪，对牛乳蛋白和常见的3种可能掺假蛋白质进行定性和半定量分析，以期建立有效可行的分析检测乳蛋白成分和牛乳中蛋白质掺假的方法。

1 实验

1.1 主要仪器及试剂

P/ACE MDQ毛细管电泳仪；未涂层熔融石英毛细管柱（50 cm×50 μm I.D）,有效长度为40 cm；高速冷冻离心机；pH酸度计。

鲜牛乳，明胶（纯度82%），大豆分离蛋白（纯度89.7%），乳清粉（纯度24.3%），α-乳白蛋白(α-La),β-乳球蛋白(β-Lg),α-酪蛋白(α-CN),β-酪蛋白(β-CN)以及κ-酪蛋白(κ-CN)标准品；羟丙基甲基纤维素(HPMC)；DL-二硫苏糖醇(DTT)，其他试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 样品处理与蛋白质标准溶液配制

样品缓冲液：准确称取DL-二硫苏糖醇(DTT)76 mg，柠檬酸钠147 mg，加入浓度为8 mol/L尿素37.5 mL,用水稀释至50 mL,浓度为1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至8.00，缓冲溶液用0.45 μm的滤膜过滤。储于冰箱备用[8]。

奶样样品的配制：鲜牛乳在5 000 g，15 min，4℃条件下离心脱脂，脱脂牛奶与样品缓冲溶液，按1∶4(体积比)的比例混合,室温下放置1 h，用0.45 μm的滤膜过滤后直接进样[9]。

掺假样品的配制：分别称取大豆分离蛋白、明胶、乳清粉30 mg各自溶解在1 mL水中，3种掺假溶液分别与脱脂牛乳按1∶9(体积比)、3∶7(体积比)的比例混合，使3种掺假溶液在脱脂牛乳中的比例分别占10%和30%。各掺假牛乳分别与样品缓冲液，按1∶4(体积比)的比例混合,室温下放置1 h,用0.45 μm的滤膜过滤后进样。

蛋白质标准溶液的配制：分别配制α-La，β-Lg，α-CN，β-CN，κ-CN的标准储备液15，20，30，40，20 mg/mL，并置于冰箱中保存。上述标准溶液与样品缓冲液按1∶4(体积比)的比例混合后进样。

1.3 毛细管电泳仪器操作条件

毛细管电泳运行缓冲液：称取磷酸二氢钠1.2284 g，50 mgHPMC，浓度为8 mol/L尿素75.2 mL，用浓度为4 mol/L的磷酸调节pH值至2.5，最后定容到100 mL。缓冲液用0.45 μm滤膜过滤，超声脱气20 s,备用[7]。

P/ACE MDQ毛细管电泳仪，未涂层熔融石英毛细管柱（50 cm×50 μm I.D）,有效长度为40 cm；分离电压为26 kV；压力进样为3.45×103Pa、时间6 s；柱温：35℃；紫外检测波长：214 nm；毛细管柱两次进样之间用水冲洗1 min，浓度为0.1 mol/L的氢氧化钠溶液冲洗2 min，再用水冲洗2 min，最后用磷酸盐缓冲液冲洗5 min。

2 结果与分析

2.1 毛细管电泳方法实验

（1）电泳条件的选择。首先用二极管阵列检测器对所分离的蛋白质进行全波长扫描，选择214 nm为检测波长。为选择最优的电泳缓冲液，分别研究了柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液在pH=2.5、3.0时的分离效果。实验表明，pH2.5的磷酸盐缓冲液适用未涂层的毛细管，可使各组分有足够大的分离度并且出峰时间短。实验中还在20～30 kV范围内考察了分离电压，表明26 kV为合适的分离电压；实验分别在柱温为25～45℃下运行，对于未涂层毛细管选择35℃为最佳柱温；添加羟丙基甲基纤维素的缓冲液可提高分离度并有效抑制蛋白吸附影响。

（2）标准蛋白质的定量分析方法结果。在上述的操作条件下，以不同浓度的α-La，β-Lg，α-CN，β-CN，κ-CN分别电泳，应用色谱软件对得到的五种标准蛋白进行分析，以各蛋白的峰面积A对浓度c进行线性回归，得到各蛋白的线性回归方程、线性范围及相关系数。所得实验参数如表1所示，由表1可以看出，5种蛋白的回归方程相关系数均大于0.997，相关性较。

表1 方法的分析特性

回收率试验，为了检验可能的蛋白吸附对测定的影响，对采购的牛乳（经脱脂）中5种牛乳蛋白进行了加标回收实验,其回收率为86%～102%(见表2)。这说明，在本研究条件下，吸附对蛋白检测的影响受到了较好的抑制。

表2 乳源蛋白质的回收率（n=3）

2.2 样品的毛细管电泳分析

2.2.1 鲜牛乳混样标准的建立

鲜牛乳混样的电泳图谱如图1所示。由于牛乳混样具有一般性，在优化的分离条件下对鲜牛乳混样的蛋白质进行分离分析，通过对照各个牛奶蛋白标准品的迁移时间（α-La为12.1 min、β-Lg为13.0 min、α-CN分别为17.0 min和17.9 min、κ-CN为19.4 min、β-CN分别为20.1 min和21.0 min），可以定性鲜牛乳混样中各蛋白峰（如图标示），由各标准品的标准曲线测定牛乳混样中各种蛋白峰的含量。由于牛乳混样具有一般性，其中各蛋白含量较为固定，从迁移时间和各峰蛋白含量可以看出牛乳是否掺假。可见牛乳混样电泳图谱的建立为牛乳掺假提供了可靠的依据。

图1 牛乳混样的电泳结果

2.2.2 鲜牛乳中掺入杂蛋白毛细管电泳图谱的建立

应用未涂层的毛细管分别对牛乳中参入大豆分离蛋白，明胶，乳清粉进行掺假检测，结果如图2～图4所示。

由图2可以看出，大豆分离蛋白的出峰时间主要集中在10～14 min之间，且大豆蛋白粉在10.5 min开始出峰，牛乳中α-La和β-Lg的出峰时间分别在11.5 min和12.5 min左右，在牛乳中掺假30%的大豆分离蛋白时也在10.5 min开始出峰。

图2 牛乳中参入大豆分离蛋白的电泳图谱

由图3可以看出，虽然明胶是多种杂蛋白的混合物，但峰的数量单一，出峰时间在13.6～16.5 min之间，牛乳中α-CN的2个峰分别在15.4 min和16.4 min左右,在牛乳中掺假30%的明胶后也是从13.6 min开始出峰到16.5 min结束。

图3 牛乳中参入大豆分离蛋白的电泳图谱

由于乳清粉中所含有的2种蛋白α-La和β-Lg均是牛乳中的蛋白质，因此乳清粉的出峰时间和牛乳乳清蛋白的出峰时间重叠。由图4可以看出，牛乳中掺入30%的乳清粉的乳清蛋白峰高于牛乳中乳清蛋白的质量浓度。

图4 牛乳中参入乳清粉的电泳图谱

由于掺假蛋白各不相同，各种牛乳掺假物在电泳图谱中都有自己相对应的蛋白峰，在优化的分离体系下，对脱脂牛乳及掺假脱脂牛乳中的蛋白组成经行了分离分析。各分析样品中的各蛋白质质量浓度如表3所示。大豆分离蛋白出峰时间在10.5 min到14 min左右。由表3可以看出，牛乳中参入30%的大豆分离蛋白溶液样品中α-La（0.57 g/L）和β-Lg（0.87 g/L）质量浓度有所增加。众所周之明胶是混合物，但峰型单一，主要集中在13.6～16.5 min之间，与α-CN出峰时间重合，由表3可以看出，牛乳中参入30%的明胶溶液样品中α-CN质量浓度增加到了3.78 g/L。乳清粉中所含2种蛋白质与牛乳乳清中所含蛋白相同，牛乳中参入30%的乳清粉溶液样品中α-La（0.28 g/L）和β-Lg（0.87 g/L）质量浓度也相应增加。在牛乳中添加杂蛋白，检测时原来的峰型会发生改变或者出现新的蛋白峰，而且峰面积与添加量成正比，这样就很容易检测到乳品中的掺杂使假情况，快速准确，可以弥补传统检测方法的缺陷。

表3 牛乳及掺假牛乳各种蛋白质量浓度g/L

3 结论

高效毛细管电泳方法对乳蛋白及掺假乳进行测定研究。选择未涂层的熔融石英毛细管进行分离，电泳优化条件为磷酸盐缓冲液(pH=2.5)，柱温35℃，分离电压26 kV，紫外检测波长214 nm。牛乳及各种掺假牛乳在30 min内得到较好的分离，5种乳蛋白在不同线性范围内的线性相关系数均大于0.997，各乳蛋白的迁移时间和峰面积的RSD分别小于0.34%和4.65%。通过牛乳混样与不同比例的掺假（大豆分离蛋白，明胶，乳清蛋白）乳比较分析，可以确定出掺假蛋白的特征峰，可用于定性测定，通过峰面积可以半定量的牛乳中掺假蛋白的添加比例。高效毛细管电泳仪器现阶段由原价格较高，致使其普及率较低，但是由于其快速高效、运行廉价和充分性较好，现价段可作为食品质量安全专业分析检测机构进行牛奶质量监控的快速有效方法。

[1] 顾瑞霞，张和平，汪家琦.乳与乳制品的生理功能特性[M].北京：中国轻工业出版社，2001.

[2] Milk—Determination of Nitrogen Content—Part 5:Determination of Protein-Nitrogen Content[S].ISO8968-5，IDF 20-5.

[3] Milk and Milk Products—Determination of Nitrogen Content—Routine Method Using Combustion According to the Dumas Principle[S].ISO 14891，IDF 185.

[4] NEIDE K K K,MAURICIO M G,CASSIA T B V Z,et al.Determination of Total Proteins in Cow Milk Powder Samples:a Comparative Study between the Kjeldahl Method and Spectrophotometric Methods[J].Journal of Food Composition and Analysis,2003，16:507-516.

[5] 张智武，许建香.3种电泳方法定量分析牛奶蛋白的比较[J].中国乳品工业，2005（8）：51-57.

[6] 王娟，张庆合，王志华，等.反相高效液相色谱法测定牛奶中的主要蛋白质[J].分析化学研究简报，2009，11（11）:1167-1170.

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[9] 刘婷，姜金斗,刘宁.毛细管电泳检测奶粉中添加的大豆分离蛋白[J].分析科学学报，2008，24（1）：37-41.

Capillary electrophoresis apparatus in the application of adulteration milk

SONG Hong-xin,LIU Li-xin,MA Yi-dong,PAN Jie
(College of Life Science&Engineering,Shaanxi University of Science&Technology,Xi’an 710021,China)

A high performance capillary electrophoresis(HPCE)method has been developed for detection of milk protein,soy protein isolate and glutin and whey protein.The melt quarz capillary without coating was used in 0.1 mol/L phosphate buffer system,the test UV wavelength is 214 nm and the separation voltage is 26 kV.Then the five proteins of milk were detected in above conditions.The liner correlations of all proteins are greater than 0.997 and the recoveries range of them is 86%～102%.The relative standard deviation(RSD)of the migration time and peak area are all less than 0.33%and 4.65%respectly.Comparing the figures of milk protein,soy protein isolate and glutin and whey protein,the characteristic peaks of different proteins could be confirmed and quantified,the reproductivity of the method is quite good.This method is rapid and accurate in detecting milk protein.

capilary electrophoresis；milk protein；soy protein isolate；glutin；whey powder

TS252.7

A

1001-2230（2010）12-0045-04

2010-09-14

宋宏新（1959-），男，教授，主要从事生物化学与分子生物学、食品科学的科研与教学工作。