不同酸奶发酵剂菌株发酵性质的评价

毛健，宁佳，赵建新，张灏

（江南大学食品学院，江苏无锡214122）

不同酸奶发酵剂菌株发酵性质的评价

毛健，宁佳，赵建新，张灏

（江南大学食品学院，江苏无锡214122）

为了筛选出优良的酸奶发酵剂，对5株乳酸菌进行了单菌的酸奶发酵实验。根据酸奶的物理性质（黏度、质构）、生长特性（活菌计数）、感官评定以及后酸化等指标进行筛选评定。结果表明：LG23的发酵乳具有较好的粘度、较小的硬度、最好的黏着力，其菌株具有较好的生长性，而54号菌株的发酵乳综合感官评价指标最好；S28菌株发酵乳的后酸化现象较为严重，其他菌株的发酵乳之间没有显著性差异。

酸奶；发酵剂；乳酸菌；分离；筛选；评价

0 引言

我国酸奶生产用的发酵剂大多停留在自繁自用的原始的液体发酵剂水平，在菌种复活、扩繁等一系列繁杂工艺中，由于技术和设备落后，造成菌种经常发生污染、退化、变异，使酸奶品质差、产品不稳定。个別酸奶生产厂家为了提高产品质量，不惜花重金从国外购买直投冷冻干燥发酵剂，但价位较高，影响产品价格。因此，自主研发高活力发酵剂，必将在与国内外同行的竞争中占据较为有利的位置，更好地为中国乳制品行业的发展服务[1]。

本课题分离不同酸奶中的乳酸菌，从滴定酸度、黏度、脱水收缩、全质构分析、细菌学检测以及后酸化角度对发酵剂进行筛选和评定，旨在筛选在物理性质、感官、后酸化性质总体优良的菌株。

1 实验

1.1 材料及设备

所用的样品1株是日本酸奶中进行分离的乳酸菌，另外的4株乳酸菌由江南大学食品学院生物技术组提供，均已进行革兰氏鉴定和接触酶鉴定，如表1。

表1 菌株的来源

分离用平板培养基采用MRS培养基、SL培养基、BCG牛乳培养基、改良M17培养基、改良MRS培养基，按文献报道的成分及配比进行配制[2]。所用设备主要包括培养菌种所用的设备。所用试剂为实验室常规分析纯化学试剂。

1.2 乳酸菌的分离

样品经预处理后，采用倾注平板法，分别取3个合适梯度的稀释菌液于MRS、M17、BCG脱脂牛乳培养基平板上，待凝固后，平板倒置，分别于35℃普通培养和厌氧培养48 h，观察菌落生长情况，挑取能使培养基中溴甲酚绿变黄的典型单菌落，并对单菌落制片进行革兰氏染色，挑取革兰氏阳性菌作为初步目的菌株，转接至MRS和M17平板纯化，4℃保存[3]。

1.3 乳酸菌的纯化

无菌条件下，接种环挑取MRS和M17平板上初步确定的革兰氏阳性的菌落，在MRS和M17平板上划线分离，35℃倒置厌氧培养24～48 h，挑取单菌落进行镜检，直至确定所得的菌株已经纯化，作为实验菌株[3]。

对于已经完成分离纯化的菌株，将其从-80℃超低温冰箱中用冰取出，放入MRS液体培养基中进行连续传代处理，直至其活力恢复。

用接种环在平板上刮一环新鲜培养的菌苔，均匀涂抹在载波片上，向上滴加一滴体积分数3%H2O2溶液，观察是否有气泡产生。若无气泡产生则表明该菌株不产生过氧化氢，为接触酶阴性菌[3]。

1.4 乳酸菌的筛选

经过分离的菌株，以体积分数2%的接种量接种到非脂乳固体质量浓度为12%的已灭菌的脱脂乳中，在42℃培养，凝乳后，记录凝乳时间，继续接种到灭菌脱脂乳培养基中，连续传代6次，选择菌株稳定性好的继续进行实验。

将1 mL的菌液加入9 mL的灭菌脱脂乳中，再加入1 mL灭菌后的刃天青标准溶液，混合均匀后在37℃下水浴加热，观察刃天青褪色时间。30 min后开始观察，其后每5 min观察一次，淡粉红色为还原终点。35 min内活力较强，50 min内可以使用，＞60 min不宜使用[6]。

1.5 凝乳情况

经过分离的菌株，以体积分数2%的接种量接种到非脂乳固体质量浓度为12%的已灭菌的脱脂乳中，在42℃培养，凝乳后，记录凝乳时间，继续接种到灭菌脱脂乳培养基中，连续传代6次，选择菌株稳定性好的继续进行实验。

1.6 发酵乳样品的制备

全脂复原乳（蔗糖6.5%、全脂粉11.5%）预热至60℃，高压均质（一段20MPa，二段4MPa），95℃5 min杀菌，冷却至42℃并接入发酵剂，于42℃培养至pH值为4.5，迅速置于冰水中冷却至4℃。各菌株接种量均为2×107g-1发酵乳。

1.7 滴定酸度

根据GB/T5009.46-1996[5]，称量10 g酸奶样品，置于100 mL三角瓶中，加入20 mL水，再加入0.5 mL 0.5%的酚酞乙醇溶液，小心摇匀，用0.1 mol/L的氢氧化钠标准溶液滴定至微红色在1 min内不消失为止。消耗的0.1 mol/L的氢氧化钠标准溶液的毫升数乘以10，即得酸度（°T），取三次测定的算术平均值。

1.8 黏度

采用NDJ-5S型黏度计在25℃进行测定，取3次测定的算术平均值。用10x的转子进行测定。

1.9 脱水收缩

称取15.0 g发酵乳样品，置于带有滤纸（双圈牌中速定性滤纸，浙江新华纸业有限公司）的漏斗中，21℃放置90 min，收集滤液并称重。

脱水收缩性/%=（滤液重g/样品重量g）×100%

1.10 全质构的测定

将发酵乳样品调温至20～22℃，采用TA-XT2质构测试仪（Stable Micro System，Godalming UK）SMS P/25平底柱形探头（直径2.5 cm、高4 cm）进行测定。测定条件为：测前速率5.0 mm/s、测试速率2.0 mm/s、测后速率2.0 mm/s，探头进入距离20 mm，两次压缩之间停留时间5s。利用质构数据分析软件由全质构曲线计算得到脆度、硬度、凝聚性、黏着性、弹性、回复性、胶性、耐嚼性值。

全质构质地分析（texture profile analysis，TPA）作为一种客观的评价方法是让仪器模拟人的咀嚼动作，一般为模拟牙齿两次压缩和拉伸动作，记录并绘出力与时间的关系，从中找出与人感官评价对应的参数。

硬度：TPA曲线第一压缩周期中最高峰处力值，反映了试样对变形抵抗的性质。黏着性：面积Area 3，下压一次后将探头于试样中拔出所需能量大小，反映了咀嚼试样时，试样对上腭、牙齿、舌头等接触面黏着的性质。凝聚性：即Area 2/Area 1，反映了咀嚼试样时，试验颗粒抵抗受损并紧密连接，使试验保持完整的性质。

1.11 细菌学检查

0.5 g发酵乳样品用灭菌生理盐水梯度稀释至一定倍数后，采用各选择培养基平板倾注法，测定活菌数。对于球菌采用M17固体培养基，杆菌采用MRS固体培养基。

1.12 后酸化评价

将发酵结束的酸奶放入-4℃的冰箱内储藏1周，每天测量其pH及滴定酸度，观察7 d内的变化。

1.13 感官评定

发酵乳感官鉴定指标参照以下文章[7-9]。

1.14 数据分析

每个发酵乳样品各指标的测定均作3个平行样。ANOVA分析、主成分分析及相关性分析均采用SAS 9.0软件（SAS Institute Inc，Cary，USA），其中ANOVA分析在P＜0.05水平下进行分析，作图采用origin 7.0软件。

2 结果与讨论

2.1 发酵乳样品pH值、滴定酸度、脱水收缩性和黏度

对用5株菌进行单菌发酵的酸奶发酵结束后，于4℃储藏24 h测定其滴定酸度、pH、黏度和脱水收缩性，得到以下结果，如表2。

表2 4℃储藏24 h后发酵乳样品酸度和脱水收缩性试验结果（n=3，x±SD）

滴定酸度的差异表明在后熟期间各菌产酸程度不同，S28号在储藏期间产酸要多于其他几株菌，其后熟性较强，可能会影响其风味。而在后来的感官评定中也证明，S28号的口感较酸，香味不足。在对酸奶样品pH值的比较中发现，虽然54号具有最低的pH，但是其滴定酸度较低，说明有可能与口感的酸度并不一致，在后面的感官评定中也表明，54号的酸甜适中，并不是最酸的菌株。

于4℃储藏24 h后，各样品的粘度值差异较大，可以看出LG23的发酵乳具有较高的黏度，而54和77的发酵乳黏度较低，对于脱水收缩敏感性，S28号发酵乳具有较好的保水性。乳清的析出是由于组成发酵乳凝胶网络的颗粒过度重排所造成的，其受多种流变学参数的影响[10]，且与发酵乳样品的酸度有关[10]。本实验中，S28号发酵乳具有最低的脱水收缩性，说明其具有最好的保水性。

2.2 发酵乳样品细菌学检查

对分离纯化的5株菌进行单菌发酵的酸奶发酵结束后4℃储藏24 h后进行活菌计数并观察其生长情况，如表3。

表3 发酵乳后熟24 h后的活菌计数（n=3,x±SD）

由活菌计数可以看出，5株菌中LG23与其他菌株的差异性显著（P＜0.05），可以看出，LG23具有最好的生长活性，经过发酵后熟24小时后，比原先接种量增加5倍。

2.3 凝固型发酵乳的全质构分析

对用上述5株菌进行单菌发酵的酸奶发酵结束后4℃储藏24 h后进行全质构测定，观察其硬度、凝聚性、黏着性的差异。从表中可以看出，LG23具有最小的硬度，而凝聚力所有菌株均无显著性差异（p＞0.05），LG23、54、55具有较大的黏着力，如表4。

表4 发酵乳后熟24h后质构的测定

2.4 凝固型发酵乳的感官鉴评

对用上述5株菌进行单菌发酵的酸奶发酵结束后4℃储藏24 h后进行感官鉴评，观察其5种酸奶在表观、气味、风味、质地上的差异。从表3-6中可以看出，在表观方面，表面粗糙性和细腻性各酸奶间有极其显著的差异（P＜0.01）；气味方面，奶味和乙醛风味显著差异（P＜0.05）：风味中酸味和乙醛风味有显著差异（P＜0.05）；质地指标中的平滑性和稠度具有极其显著的差异（P＜0.01）。也就是说，这5种酸奶在这些因素上有较大的差别。通过比较发酵乳产品喜好程度可知产品在苦味、涩味、块状、酸臭味等指标上得分较低，即产品在这7个指标上不存在质量缺陷问题。

表5 发酵乳样品各感官鉴评指标的平均值范围、F值以及显著性

为了进一步了解这5株单菌发酵乳的感官特征，对发酵乳样品的各感官鉴评指标得分进行了主成分分析。由表3-7可知，在所有发酵乳制品感官鉴评主成分中，信息主要集中在前3个主成分，其累计方差贡献率为96.57%。其中第一主成分贡献率64.60%为最大，第2、和3主成分的贡献率分别为19.65%和12.31%。说明细腻性、表观粗糙、表观总体得分是最为主要发酵乳感官评价指标。

表6 酸奶感官鉴评得分主成分的特征值和方差贡献率

根据计算样本相关矩阵的特征向量可给出主成分的函数式为：

Y1=0.29X1－0.28X2＋0.34X3＋0.31X4＋0.30X5＋0.30X6－0.05X7＋0.33X8＋0.24X9＋0.33X10－0.15X11＋0.23X12＋0.33X13（1）

Y2=0.02X1＋0.14X2－0.09X3－0.23X4－0.29X5－0.19X6+0.36X7－0.15X8＋0.42X9－0.08X10－0.49X11＋0.46X12＋0.11X13（2）

Y3=0.41X1＋0.41X2－0.12X3＋0.18X4－0.08X5＋0.13X6+0.63X7＋0.17X8－0.15X9＋0.14X10＋0.34X11－0.03X12－0.03X13（3）

由函数式看出，在第1主成分Y1中，X3、X4、X5、X6、X8、X10及X13的系数最大，表明第一主成分大时表观总体得分、乙醛气味、气味总体得分、酸味、风味总体得分、平滑性、产品总得分较大。在第2主成分Y2中，X9、X11及X12的系数最大，表明第二主成分大时稠度、粉质、质地总体得分较大。在第3主成分Y3中，X1、X2及X7系数最大，表明第三主成分大时细腻性、表面粗糙、乙醛风味较大。由以上讨论可知13个变量可以分为四类：﹛X3、X4、X5、X6、X8、X10、X13﹜，﹛X9、X11、X12﹜，﹛X1、X2、X7﹜。

图1 发酵乳感官鉴评的主成分1与主成分2因子载荷图

从图3-1中可以看出，表面粗糙与细腻性呈负相关，粉质和稠度也呈负相关。而乙醛气味、风味、酸味、气味以及表观是有一定正相关性的。

图2 发酵乳感官鉴评的主成分1与主成分2因子得分图

由图3-2的主成分分析可知：77号菌株的发酵乳粉质得分较高，产品总体感官最差。54号菌株的发酵乳：表观、气味、风味以及产品总得分高、平滑性高、酸度大，乙醛气味浓，产品总体感官最好。LG23菌株的发酵乳质地总得分最高、最为黏稠。

2.5 发酵剂的后酸化评价

发酵终止后，储藏7 d，对酸奶滴定酸度的变化进行测定，发现S28号菌发酵乳的滴定酸度增加了25.2°T，其他菌的滴定酸度变化不足5°T，可知，S28号的后酸化情况比其他株严重。

图3 在储藏期间酸奶滴定酸度的变化

3 结论

发酵剂的评定通过对发酵酸奶的滴定酸度、黏度、脱水收缩、全质构分析、细菌学检测以及后酸化评定进行，系统化地对发酵剂进行了评价，其中LG23具有较好的黏度、较小的硬度、最好的黏着力以及最好的生长性，而54号总体感官最好。

[1] 黄良昌，吕晓玲，邢晓慧．酸奶发酵剂的研究进展[J]．广州食品工业科技，2001，67（3）：43-49.

[2] 郭本恒．乳品微生物学[M]．北京：中国轻工业出版社,1999.214-270.

[3] 凌代文,东秀珠．乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M]．北京：中国轻工业出版社,1999.84-100.

[4] 顾瑞霞．应用于发酵乳生产的乳酸菌[J]．微生物学通报,1992.19(3)：183-185.

[5] GB/T5009.46-1996乳与乳制品卫生标准的分析方法[S].北京：中国标准出版社，1997.

[6] 杜鹏．乳品微生物实验技术[M]．北京：中国轻工业出版社,2008：115-120.

[7] SAINT-EVE A,KORE E P,MARTIN N.Impact of The Olfactory Quality and Chemical Complexity of The Flavouring Agent on The Texture of Low Fat Stirred Yogurts Assessed by Three Different Sensory Methodologies[J].Food Quality and Preference,2004,15,655-668.

[8] ISLETEN M，KARAGUL-YUCEER Y.Effects of Dried Dairy Ingredients onPhysical and Sensory Properties of Nonfat Yogurt[J].J Dairy Sci，2006，89，2865-2872.

[9] HARPER S J，BARMES D L,BODYFELT F W.Sensory Ratings of Commercial Plain Yogurts by Consumer and Descriptive Panels[J].J Dairy Sci，1991，74，2927-2935.

[10] HASSAN A N，FRANK J F，SCHMIDT K A，et al.Rheological Propertiesof Yogurt Made with Encapsulated Nonropy Lactic Cultures[J].J DairySci，1996，79：2091–2097.

Study on the fermentation character of different yogurt strains

MAO Jian，NING Jia，ZHAO Jian-xin，ZHANG Hao
(School of Food Science and Technology，Jiangnan University,Wuxi 214122，China)

To screen starter cultures for yogurt production，the fermentation characteristics of 5 lactic acid bacteria strains were studied.According to the stability and coagulation time of the strains and the properties of the fermented milks such as syneresis，texture profileanalysis and sensory evaluation.The results showed that the fermented milks made with strain LG23 had high viscosity and adhesiveforce，with softer texture than the fermented milks made with the other strains.The fermented milk made with strain 54 had thebest sensory scores.On the other hand，strong post-acidification was observed in the fermented milk made with strain S28.

yogurt；starter culture；lactic acid bacteria；isolation；screening；valuation

TS252.54

A

1001-2230（2010）12-0008-04

2010-08-09

毛健（1970-），男，副教授，从事食品发酵技术方面的研究。