清毒祛痨丸的薄层色谱鉴别及没食子酸的含量测定

杨荣艳，王倩，刘晓秋，华会明*

（1.沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110016；2.中国药科大学，江苏 南京 210009；3.四平市食品药品检验所，吉林 四平 136000）

清毒祛痨丸的薄层色谱鉴别及没食子酸的含量测定

杨荣艳1，3，王倩2，刘晓秋1，华会明1*

（1.沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110016；2.中国药科大学，江苏 南京 210009；3.四平市食品药品检验所，吉林 四平 136000）

目的：建立清毒祛痨丸的鉴别和含量测定方法。方法：用TLC对玄参、黄芪、连翘、地榆进行鉴别；用HPLC测定没食子酸的含量。结果：薄层鉴别斑点清晰；没食子酸平均加样回收率为98.7%，RSD＝1.2%。结论：鉴别重复性好，专属性强，含量测定方法简便、准确，可用于清毒祛痨丸的质量控制。

清毒祛痨丸；TLC鉴别；HPLC测定；没食子酸

清毒祛痨丸是四平结核病医院多年临床经验方，由地榆、黄芪、玄参、连翘、桔梗等20味药组成，用于治疗各型肺结核，淋巴结核，结核胸膜炎，腹膜炎，脑膜炎，肾结核，骨结核等结核病。该丸剂是水蜜丸，临床疗效显著。但目前尚缺乏有效的质量控制方法，为了有效控制清毒祛痨丸的质量，保证其临床疗效，本文采用TLC对方中具有抑菌解毒、治痨杀虫、利水渗湿、排脓生肌、补气生津功效的药材玄参、地榆、黄芪、连翘进行鉴别，获得满意结果；没食子酸是地榆的指标性成分，具有抗菌、抗病毒、抗真菌作用，并有抗炎症、抗肿瘤、抗过敏、抗诱变的作用，因 《中国药典》2005版没有收载HPLC测定地榆中没食子酸的含量，所以本文建立了HPLC测定制剂中没食子酸的含量，结果表明方法简便、快速、准确。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2010AHT型高效液相色谱仪（岛津）；CLASSVP色谱工作站；UV-260可见-紫外分光光度计；紫外检测器，AE240电子分析天平；LC-250超声清洗器，功率250W，频率50kHZ；纯水器（德国）。

1.2 试药

清 毒 祛 痨 丸 （批 号 20090901，20090902，20090903，四平结核病医院提供）。没食子酸对照品（批号 110831-200302）、哈巴俄苷对照品（批号111730-200604）、连翘苷对照品（批号 110821-200609）、黄芪甲苷对照品（批号0781-200311）均购自中国药品生物制品检定所，市售硅胶G板（上海盛亚化工有限公司，批号20090306），D101型大孔树脂（天津市光复精细化工研究所，批号20090107）。

乙腈、甲醇均为色谱纯（天津康科德科技有限公司），其他试剂均为分析纯。水为实验室自制的超纯水。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 玄参的鉴别 取本品25g，研细，加甲醇50mL，浸泡1h后，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水25mL，微热使溶解，用乙醚振摇提取3次，每次30mL，弃去乙醚液，再用醋酸乙酯振摇提取3次，每次30mL，弃去醋酸乙酯液，继续用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次25mL，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液。另取哈巴俄苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。按处方比例，同法制备缺玄参阴性对照溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2005年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述3种溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（16∶4∶1）的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照不干扰测定，见图1。

2.1.2 黄芪的鉴别 取本品22g，研细，加甲醇60mL，回流提取3h，提取液蒸干，加水30mL，使溶解，用水饱和乙醚液提取4次，每次30mL，弃去乙醚液，用水饱和正丁醇提取3次，每次30mL，合并提取液，回收正丁醇液至干，残渣加水5mL使溶解，上已处理好的 D101型大孔吸附树脂柱（长16cm，内径1.5cm），以水100mL洗脱，弃去水液，再用40%乙醇140mL洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇180mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水饱和正丁醇20mL使溶解，用正丁醇饱和氨试液提取3次，每次30mL，弃去，再用正丁醇饱和水30mL提取2次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。按处方比例，同法制备缺黄芪的阴性对照溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2005年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述3种溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图2。

图1 清毒祛痨丸中玄参TLC图

图2 清毒祛痨丸中黄芪TLC图

2.1.3 连翘的鉴别 取本品24g，研细，加石油醚（30～60℃）50mL，密塞，超声处理15min，滤过，弃去石油醚，残渣挥干，加甲醇50mL，超声处理20min，滤过，滤液蒸干，残渣加水25mL微热使溶解，加醋酸乙酯振摇提取3次，每次30mL，合并醋酸乙酯液，蒸干，残渣加30%乙醇5mL使溶解，通过D101型大孔树脂柱（内径1.5cm，柱高10cm），用30%乙醇50mL洗脱，弃去洗液，再用稀乙醇50mL洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取连翘苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.25mg的溶液，作为对照品溶液。按处方比例，同法制备缺连翘阴性对照溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2005年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述3种溶液各4μL，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（17∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图3。

2.1.4 地榆的鉴别 取本品24g，研细，加水100mL，煮沸30min，放冷，离心10min，取上清液，用盐酸饱和的乙醚振摇提取2次，每次30mL，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取没食子酸对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。按处方比例，同法制备缺地榆阴性对照溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2005年版一部附录ⅥB）试验，吸取供试品溶液、阴性样品溶液各5μL，对照品溶液2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯（水饱和）-醋酸乙酯-甲酸（6∶3∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图4。

图3 清毒祛痨丸中连翘TLC图

图4 清毒祛痨丸中地榆TLC图

2.2 没食子酸含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相：乙腈-0.05%磷酸溶液（1∶99），流速：1.0mL·min－1，检测波长：272nm，柱温：30℃，进样量：10μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取经P2O5干燥12h后的没食子酸对照品适量，加水制成10μg·mL－1的溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品适量，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加10%盐酸溶液20mL，加热回流3h，放冷，滤过，滤液置100mL量瓶中，用水适量分数次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性制剂及阴性对照液的制备 按处方组成比例制备缺地榆阴性制剂，再按供试品溶液的制备方法，制备地榆阴性对照溶液。

2.2.5 系统适用性试验 在选定的色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果没食子酸与其相邻峰之间分离度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05，阴性样品不干扰测定。理论塔板数按没食子酸峰计算均不低于8 000，HPLC图见图5。

图5 清毒祛痨丸HPLC图

2.2.6 线性关系考察 取没食子酸对照品约10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密量取没食子酸对照品储备液 0.1，0.3，0.5，0.8，1.0，1.5mL至10mL量瓶中，分别加水至刻度，摇匀，制成没食子酸标准系列浓度溶液。分别精密吸取上述溶液各10μL进样，在上述色谱条件下进行HPLC分析，以没食子酸峰面积Y对浓度X（μg·mL－1）回归分析，得回归方程：Y＝3.2×104X+1 430.1，r＝0.999 9，结果表明没食子酸在2.12～31.8μg·mL－1与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.7 稳定性试验 取供试品溶液，室温放置，于0，3，6，9，12h分别进样，按上述色谱条件分析，记录没食子酸峰面积，计算RSD＝1.4%。表明没食子酸样品溶液至少在12h内基本稳定稳定。

2.2.8 精密度试验 取没食子酸对照品溶液，在上述色谱条件下，重复进样6次，记录峰面积，计算RSD＝0.8%。

2.2.9 重复性试验 精密称取同一批号样品（批号20090901）6份，照 “2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算RSD＝1.5%，结果表明本法重复性良好。

2.2.10 回收率试验 取己知含量的本品粉末（批号20090901）6份，每份约1g，精密称定，分别精密加入一定量的对照品溶液，按 “2.2.3”供试品溶液的制备项下方法操作，在上述色谱条件下进样分析，计算平均回收率，结果见表1。

表1 没食子酸加样回收率试验

2.2.11 样品的测定 按供试品制备方法，每批样品制备两份，测定没食子酸的含量，结果20090901，20090902，20090903批清毒祛痨丸中没食子酸含量分别为 0.192，0.215，0.176 mg·g－1。

3 讨论

清毒祛痨丸为中药大复方制剂，成分复杂，各成分之间干扰较严重，通过多次试验筛选出合理的供试品溶液制备方法和色谱分离系统，对其中主要药味玄参、黄芪、连翘、地榆进行鉴别，并对地榆中的没食子酸进行含量测定，经过3批样品测定表明，该方法简便易行，薄层色谱斑点分离清晰，重现性好，阴性对照无干扰，可以作为该制剂的质量控制方法。

3.1 薄层色谱条件考察

3.1.1 玄参 在玄参的薄层色谱鉴别中，参照了《中国药典》（2005年版）的薄层色谱条件［1］，在供试品处理步骤中增加了用乙醚和醋酸乙酯萃取过程，以除去一些脂溶性成分的干扰，并增加水饱和的正丁醇提取，以净化供试品溶液，试验结果斑点清晰，阴性无干扰。

3.1.2 黄芪 在黄芪的薄层色谱鉴别中，参照了《中国药典》（2005年版）［2］，但供试品处理步骤中改用大孔吸附树脂柱代替 《中国药典》记载的中性氧化铝柱，又考察以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下层溶液、氯仿-甲醇-正丁醇-水（2∶1∶4∶2）10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，结果前者薄层效果优于后者，薄层斑点更加清晰，专属性强，阴性对照无干扰。

3.1.3 连翘 在连翘薄层色谱鉴别中［3］，由于背景干扰较大，为除去干扰，供试品处理步骤中增加了石油醚脱脂，使背景干扰可以消除。又考察了D101型大孔树脂柱（内径1.5cm，柱高10cm）、聚酰胺柱（14～30目，3g，内径1～1.2cm，用水50mL预洗）两种色谱柱，试验结果表明D101型大孔树脂柱处理的薄层效果优于聚酰胺柱，斑点清晰，专属性强，阴性对照无干扰。

3.1.4 地榆 在地榆的薄层色谱鉴别中［1］，展开缸预平衡15min，水饱和的甲苯需放置过夜后使用，薄层效果最佳。

3.2 高效液相色谱条件考察

没食子酸的含量测定的色谱条件［4］，考察了不同色谱柱Zorbax SB－C18柱（250mm×4.6mm，5μm）和Diamonsil C18柱（250mm×4.6mm，5μm），结果表明用Diamonsil C18柱分离度较好。考察了不同流动相的比例及酸度对分离度和峰形的影响：0.1%磷酸-乙腈（75∶25）、0.1%磷酸-乙腈（85∶15）、0.1%磷酸-乙腈（99∶1）、0.05%磷酸-乙腈（85∶15）、0.05%磷酸-乙腈（99∶1），结果表明 0.05%磷酸-乙腈（99∶1）最理想，不仅使色谱峰峰形好，而且与相邻杂峰的分离度均大于1.5。设定恒定柱温时，色谱峰的保留时间几乎相差不大，若不设柱温时，温度差异会影响色谱峰的保留时间的变化。

3.3 没食子酸检测波长的选择

取一定浓度的对照品溶液，用紫外分光光度计在200～400nm波长进行光谱扫描，结果在217和272nm处分别有最大吸收，但在272nm处色谱峰峰形更理想，与杂峰分离度更好，故选定272nm为检测波长。

［1］国家药典委员会.中国药典中药材薄层色谱彩色图集［M］.北京：人民卫生出版社，2009：206，220.

［2］国家药典委员会.中国药典（一部）［S］.北京：化学工业出版社，2005：76-77.

［3］国家药典委员会.中国药典（一部）［S］.北京：化学工业出版社，2005：212.

［4］国家药典委员会.中国药典（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：117.

TLC Identification and Determination of Gallic Acid in Qingdu Qulao Pill

Yang Rongyan1，3，Wang Qian2，Liu Xiaoqiu1，Hua Huiming1
（1.Shengyang Pharmaceutical University，Shengyang Liaoning110016，China；2.China Pharmaceutical University，Nanjing Jiangsu210009，China；3.Siping City Institute for Food and Drug Control，Siping Jilin136000，China）

Objective：To establish identification and determination method of Qingdu Qulao Pill.Methods：TLC was employed to identify four crude herbal elements in Qingdu Qulao Pill and the content of gallic acid was determined by HPLC.Results：The spot developed on TLC was fairly clear.The average recovery of gallic acid was 98.7%with RSD 1.2%.Conclusion：The identification methods are reproducible and specific and the determination method is simple and accurate，which can be used for the quality control of Qingdu Qulao Pill.

Qingdu Qulao Pill；TLC；HPLC

*华会明，E-mail：huimhua＠163.com

2010-04-22）