HPLC测定市售青黛中靛蓝和靛玉红的含量

白宗利，任玉珍，陈彦琳，杜杰，梁焕，彭秀娟，周林，田壮，屈效源

（中国药材公司，北京 100195）

HPLC测定市售青黛中靛蓝和靛玉红的含量

白宗利*，任玉珍，陈彦琳，杜杰，梁焕，彭秀娟，周林，田壮，屈效源

（中国药材公司，北京 100195）

目的：建立青黛中靛蓝和靛玉红含量的测定方法。方法：采用HPLC定量分析，色谱柱为Diamonsil C18（150mm×4.6mm，5μm），靛蓝流动相为甲醇-水（60∶40），流速为1.0mL·min-1，检测波长为610nm；靛玉红流动相为甲醇-水（70∶30），流速为1.0mL·min-1，检测波长为 292nm。结果：靛蓝在 0.029 6～0.296μg（r＝0.999 9）与峰面积呈良好线性关系，靛玉红在0.010 6～0.127 2μg（r＝0.999 9）与峰面积呈良好线性关系。结论：HPLC操作简便、结果可靠、重现性好、专属性强，可用于青黛中有效成分含量的测定。

青黛；靛蓝；靛玉红；高效液相色谱法

青黛为爵床科植物马蓝Baphicacanthus cusia（Nees）Bremek.、蓼科植物蓼蓝Polygonum tinctoriumAit.或十字花科植物菘蓝Isatis indigoticaFort.的叶或茎叶经加工制得的干燥粉末、团块或颗粒。具有清热解毒，凉血消斑，泻火定惊的功能。用于温毒发斑，血热吐衄，胸痛咳血，口疮，痄腮，喉痹，小儿惊痫［1］。青黛的主要有效成分是靛蓝和靛玉红，《中国药典》2005年版一部中分别采用紫外-可见分光光度法和薄层色谱扫描法对其含量进行测定［2］，但这些方法存在着操作繁琐、重现性差等问题。我们通过修订 《北京市中药炮制规范》，参考 《中国药典》2005年版一部蓼大青叶项下 “含量测定”［3］和 《中国药典》2010年版一部青黛项下 “含量测定”中靛玉红的含量测定［1］，采用高效液相色谱法分别测定了9批市售青黛样品中靛蓝和靛玉红的含量，现将结果报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

waters2695液相色谱仪，DAD2996检测器；岛津uv2550紫外分光光度计；KQ3200超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DENVER电子分析天平（1／10万，北京赛多利斯仪器系列有限公司）。

1.2 试药

靛蓝对照品（批号110716-200509，供含量测定用）；靛玉红对照品（批号110717-200204，供含量测定用），均购自中国药品生物制品检定所。

1.3 试剂与样品

三氯甲烷、水合氯醛、甲苯、丙酮为分析纯；甲醇为色谱纯；水为娃哈哈纯净水；硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂）。

青黛样品分别从北京市5家中药饮片厂和北京市知名药店收集，共9批，编号及来源详见表1。经北京市卫生学校金世元教授鉴定为爵床科植物马蓝Baphicacanthus cusia（Nees）Bremek.、蓼科植物蓼蓝Polygonum tinctoriumAit.或十字花科植物菘蓝Isatis indigoticaFort.的叶或茎叶经加工制得的干燥粉末。

表1 青黛样品编号及来源

2 方法与结果

2.1 青黛中靛蓝含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-水（60∶40）；柱温：30℃；流速：1mL·min－1；检测波长：610nm；进样量：10μL；理论板数按靛蓝峰计算应不低于1 800。2.1.2对照品溶液的制备 取靛蓝对照品3.7mg，精密称定，置250mL量瓶中，加2%水合氯醛的三氯甲烷溶液（取水合氯醛，置硅胶干燥器中放置24h，称取2.0g，加三氯甲烷至100mL，放置，出现浑浊，以无水硫酸钠脱水，滤过，即得。）约200mL，超声处理（功率250W，频率33kHz）1.5h，取出，放冷至室温，加2%水合氯醛的三氯甲烷溶液至刻度，摇匀，即得浓度为0.014 8mg·mL－1的对照品溶液。靛蓝对照品HPLC图见图1。

图1 靛蓝对照品HPLC图

2.1.3 供试品溶液的制备 取青黛细粉约25mg，精密称定，置25mL量瓶中，加2%水合氯醛的三氯甲烷溶液约 20mL，超声处理（功率 250W，频率33kHz）1.5h，取出，放冷，加2%水合氯醛的三氯甲烷溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。青黛样品HPLC图见图2。

图2 青黛样品HPLC图

2.1.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液2，5，10，12，15，20μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积；以靛蓝进样量为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标作线性回归，得回归方程：Y＝350 218 6.2X-322 56.0（r＝0.999 9），结果表明，靛蓝在0.029 6～0.296μg与峰面积呈良好线性关系。

2.1.5 精密度试验 精密吸取上述配制的靛蓝对照品溶液10μL，重复进样6次，测定峰面积，结果RSD＝0.5%；精密吸取上述配制的供试品溶液10μL，重复进样 6次，测定靛蓝峰面积，结果RSD＝0.7%，表明本方法精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10μL，分别于0，2，4，6，8，12h时进样，测定靛蓝峰面积，结果RSD＝1.6%，表明样品溶液在12h内基本稳定。

2.1.7 重复性试验 取同一批青黛样品6份，按供试品溶液的制备方法制备，照上述色谱条件各进样10μL测定，结果靛蓝的平均含量为1.86%，RSD＝0.5%，说明本方法重复性良好。

2.1.8 回收率试验 取已知靛蓝含量的青黛（含量为1.86%）12.5mg，精密称定，共6份，置25mL量瓶中，分别加入浓度为11.98μg·mL－1的靛蓝对照品溶液，按供试品溶液的制备方法制备，照上述色谱条件测定，计算回收率。结果见表2。

表2 靛蓝加样回收率试验

2.1.9 检测限和定量限试验 采用信噪比法，先进1针空白溶剂，测出噪音，进已知浓度靛蓝对照品，根据其对应的峰高值，将对照品溶液稀释至约3倍信噪比浓度，测得靛蓝的检测限为0.710 4μg·mL－1；同样将对照品稀释至约10倍信噪比的浓度，重复进样5～6次，测得靛蓝的定量限为2.368μg·mL－1。

2.1.10 样品靛蓝含量测定结果 取9批青黛样品，按上述方法进行靛蓝含量测定，结果（以干燥品计）见表4。

2.2 青黛中靛玉红含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-水（70∶30）；柱温：25℃；流速：1mL·min－1；检测波长：292nm；进样量：10μL；理论板数按靛玉红峰计算应不低于3 000。

2.2.2 对照品溶液的制备 取靛玉红对照品2.65mg，精密称定，置50mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺约45mL，超声处理（功率250W，频率33kHz）至溶解完全，取出，放冷至室温，加N，N-二甲基甲酰胺至刻度，摇匀；精密量取10mL，置100mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺至刻度，摇匀，即得0.005 3mg·mL－1的对照品溶液。靛玉红对照品HPLC图见图3。

图3 靛玉红对照品HPLC图

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品适量，研细，取约50mg，精密称定，置25mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺约20mL，超声处理（功率250W，频率33kHz）30min，取出，放冷，加 N，N-二甲基甲酰胺至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。青黛样品HPLC图见图4。

图4 青黛样品HPLC图

2.2.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液2，4，8，16，20，24μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积；以靛玉红进样量为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标作线性回归，得回归方程Y＝276 21X－175 72.0（r＝0.999 9），结果表明，靛玉红在0.010 6～0.127 2μg与峰面积呈良好线性关系。

2.2.5 精密度试验 精密吸取上述配制的靛玉红对照品溶液10μL，重复进样6次，测定峰面积，结果RSD＝0.3%；精密吸取上述配制的供试品溶液10μL，重复进样6次，测定靛玉红峰面积，结果RSD＝1.0%，表明本方法精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10μL，分别于0，2，4，6，8，12h进样，测定靛玉红峰面积，结果RSD＝0.7%，表明样品溶液在12h内基本稳定。

2.2.7 重复性试验 取同一批青黛样品6份，按供试品溶液的制备方法制备，照上述色谱条件各进样10μL测定，结果靛玉红的平均含量为0.108 3%，RSD＝1.4%，说明本方法重复性良好。

2.2.8 回收率试验 取已知靛玉红含量的青黛（含量为0.11%）25mg，精密称定，共6份，置25mL量瓶中，分别加入浓度为0.005 3mg·mL－1的靛玉红对照品溶液，按供试品溶液的制备方法制备，照上述色谱条件测定，计算回收率，结果见表3。

表3 靛玉红加样回收率试验

2.2.9 检测限和定量限试验 采用信噪比法，先进1针空白溶剂，测出噪音，进已知浓度靛玉红对照品，根据其对应的峰高值，将对照品溶液稀释至约3倍信噪比浓度，测得靛玉红的检测限为 0.361μg·mL－1；同样将靛玉红对照品稀释至约10倍信噪比的浓度，重复进样5～6次，测得靛玉红的定量限为1.06μg·mL－1。

2.2.10 样品靛玉红含量测定结果 取9批青黛样品，按上述方法进行靛玉红含量测定，结果（以干燥品计）见表4。

表4 9批次青黛样品中靛蓝和靛玉红含量测定／%

3 讨论

《中国药典》2005年版一部青黛项下规定靛蓝含量不少于2.0%，靛玉红含量不少于0.13%。《中国药典》2010年版虽然修订了靛蓝的含量测定方法，但有关限度未变。本文测定结果表明，收集的9批市售青黛样品中，有1批样品靛蓝含量小于2.0%，有6批样品靛玉红含量小于0.13%，说明目前市场流通使用的青黛质量问题严重，应引起有关部门的重视。 实验表明，HPLC操作简便、结果可靠、重现性好、专属性强，可用于青黛中有效成分含量的测定。

［1］国家药典委员会.中国药典（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：185.

［2］国家药典委员会.中国药典（一部）［S］.北京：化学工业出版社，2005：138-139.

［3］国家药典委员会.中国药典（一部）［S］.北京：化学工业出版社，2005：253.

Determ ination of Indigo and Indirubin in Indigo Naturalis by HPLC

Bai Zongli，Ren Yuzhen，Chen Yanlin，Du jie，Liang Huan，Peng Xiujuan，Zhou Lin，Tian Zhuang，Qu Xiaoyuan
（China National Corp.of Traditional＆Herbal Medicine，Beijing100195，China）

Objective：To determine the contents of indigo and indirubin in indigo naturalis.Methods：The contents of indigo and indirubin were determined by HPLC.The chromatographic column was Diamonsil Cl8（150mm×4.6mm，5μm）.The mobile phase was methanol-water（60∶40）and the flow rate was 1.0mL·min－1with detection wavelength of 610nm for indigo.The mobile phase was methanol-water（70∶30）and the flow rate was 1.0mL·min－1with detection wavelength of 292nm for indirubin.Results：The linear correlation of the indigo was good in the range of 0.029 6～0.296μg（r＝0.999 9）.The Linear correlation of the indirubin was good in the range of 0.010 6～0.127 2μg（r＝0.999 9）.Conclusion：HPLC method is simple and the result is reliable with good repeatability and can be used for the determination of the components in indigo naturalis.

Indigo naturalis；Indigo；Indirubin；HPLC

*白宗利，E-mail：baizl＠sino-tcm.com

2010-03-18）