Pgp、MRP1和GST介导乳腺癌细胞对As2O3耐药的初步研究

印国兵,孙治君,郭 丹,杨 露,林子晶,范胜浩

(重庆医科大学附属第二医院普外科 400010)

自从20世纪70年代发现三氧化二砷(As2O3)有抗肿瘤作用以来,恶性肿瘤细胞是否对其耐药一直存在广泛争议,为此,本文对乳腺癌多药耐药MCF-7/ADR细胞及其亲本MCF-7细胞对As2O3的耐药状况进行了研究,并对相关机制作了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 MCF-7/ADR细胞购自中山医科大学肿瘤研究所,MCF-7细胞由重庆医科大学附属第一医院普外科实验室馈赠。RMPI1640培养液由干粉按说明书配制而成,加10%胎牛血清(杭州四季青公司产品)。亚砷酸注射液(含 As2O31 mg/mL,每支10 mg)以生理盐水配成200μmol/L储备液,存放于-80℃,临用时以培养液稀释到相应浓度。临用前1 d将MTT干粉以生理盐水配成5 mg/mL。Pgp、MRP1免疫组化试剂盒购自武汉博士得公司;GST试剂盒购自南京建成公司。

1.2 研究方法

1.2.1 MTT实验 将细胞培养于37℃、5%CO2及饱和湿度条件下,MCF-7/ADR细胞培养液中加入5μmol/L的阿霉素维持培养,实验前1周停药。MCF-7/ADR和MCF-7细胞均按 As2O30.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、16.0 μmol/L 分为 7 个实验组,设阴性对照和空白对照。将对数生长期的上述两种细胞按103/mL分别接种于5块96孔培养板,每孔200μL,每组设4个复孔,重复3遍。待细胞贴壁后,更换含有相应浓度As2O3的培养液,但阴性对照不加As2O3,空白对照只加培养液。加药后每24 h各取出一块培养板,分别加入20μL MTT,继续培养4 h,加入150μL DMSO振荡溶解10 min,用空白对照调零,在酶联仪490 nm波长下检测各孔的吸光值。生长抑制率=(阴性对照组OD值-药物组OD值)/阴性对照组OD值×100%。

1.2.2 Pgp、MRP1表达的测定及结果判断 MCF-7和 MCF-7/ADR细胞设空白组、0.5μmol/L组、2.0μmol/L组,每组20个标本。细胞直接培养于6孔板内的盖玻片上,细胞进入对数生长期后,空白组不加药,药物组加入相应浓度As2O3继续培养48 h,取出盖玻片,PBS液洗片,丙酮固定,依照SABC免疫组化试剂盒说明书进行染色。根据每张载玻片上至少10个视野(大于200个细胞)中阳性细胞数的比例计算表达率。另参照Simler等的方法进行染色强度分级,(-):胞膜及胞浆内无明显染色,放大倍数为10×40时仍难辨认;(+):浅着色,胞膜及胞浆内部分为浅棕色,放大倍数为10×40时可以辨认,但着色弱,放大倍数为10×10时难辨认;(++):中度着色,胞膜及胞浆内均为浅棕色,放大倍数为10×10时能辨认;(+++):强着色,胞膜及胞浆内深着色,放大倍数为10×10时能清楚辨认。

表1 两种细胞用药前后Pgp、MRP1的阳性表达率±s,%)

表1 两种细胞用药前后Pgp、MRP1的阳性表达率±s,%)

空白组0.5μmol/L组2.0μmol/L组癌株P Pgp MRP1Pgp MRP1Pgp MRP1 MCF-7 45.82±5.91 35.99±4.10 47.51±6.12 38.19±4.62 48.80±6.90 37.14±5.82 ＞0.05 MCF-7/ADR 66.67±6.99 46.54±4.79 72.15±6.93 61.11±5.03 85.87±7.72 64.72±5.64 ＜0.05 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

1.2.3 GST活性的测定 MCF-7和MCF-7/ADR细胞均取空白组、0.5μmol/L组、2.0μmol/L组进行测定,每组15个标本。细胞培养于100 mL培养瓶内,细胞进入对数生长期后,空白组不加药,药物组加入相应浓度As2O3继续培养48 h,胰酶消化收获细胞,调整每个标本内细胞数至107,加入匀浆介质(0.86%生理盐水),冰浴条件下在匀浆管中充分研磨,制成细胞匀浆,用Lowry法测定蛋白含量,然后调整蛋白含量至约5 mg/mL后进行GST酶活性的测定。操作过程按照GST试剂盒说明书进行。

1.3 统计学方法 结果用SAS8.1统计软件进行分析,MTT试验和GST测定结果采用方差分析,Pgp、M RP1表达情况采用χ2检验。

2 结 果

2.1 As2O3对MCF-7/ADR和MCF-7细胞的不良反应 不同剂量As2O3对MCF-7/ADR和MCF-7细胞的抑制率随时间的变化分别见图1、2。可见,0.5～1.0μmol/L的 As2O3对MCF-7/ADR和MCF-7细胞抑制作用都较弱,而2.0～16.0 μmol/L的As2O3对两种细胞均有抑制作用,并呈时间剂量依赖关系;其 96 h的 IC50分别为 12.8μmol/L和3.0μmol/L。单因素重复测定的方差分析显示作用时间和作用浓度对两种细胞都有正向的交互作用,在相同条件下,As2O3对MCF-7/ADR和MCF-7细胞抑制率的两两比较差异有统计学意义(P＜0.05),前者的抑制率明显低于后者。

图1 As2O 3对MCF-7/ADR细胞的生长抑制作用

2.2 Pgp、M RP1免疫组化测定结果 见表1。采用χ2检验,MCF-7细胞用药前后各组间Pgp、MRP1的表达差异无统计学意义(P＞0.05),而MCF-7/ADR细胞用药前后各组间Pgp、MRP1的表达差异有统计学意义(P＜0.05),相同组别下MCF-7/ADR细胞Pgp、MRP1的表达率均显著强于MCF-7细胞(P＜0.05),且表达强度也强于 MCF-7细胞(图3、4)。

图2 As2O3对MCF-7细胞的生长抑制作用

图 3 用药前后 Pgp的表达情况(SABC 10×40)

图4 用药前后MRP1的表达情况(SABC 10×40)

2.3 用药前后GST活性 见表2。未用药前MCF-7/ADR细胞GST活性高于MCF-7细胞,用药后MCF-7/ADR细胞GST活性进一步增高,而MCR-7细胞未出现此情况。

表2 两种细胞用药前后GST活性测定结果(u/mg±s)

表2 两种细胞用药前后GST活性测定结果(u/mg±s)

方差分析显示,a与d、b与e、c与f比较,P ＜0.05;d与e、d与f比较,P＜0.05;而a与b、a与c比较,P＞0.05。

癌株 空白组 0.5μmol/L组2.0μmol/L组 P MCF-7 4.80±1.13a 5.29±1.22b 5.62±1.48c ＞0.05 MCF-7/ADR 9.36±1.90d 16.94±2.73e 19.25±2.84f ＜0.05 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 讨 论

已有一些研究表明,As2O3对多种恶性肿瘤有治疗作用[1],也有报道认为As2O3可部分逆转入乳腺癌MCF-7/ADM细胞对ADM的耐药性,其逆转机制可能与细胞内GST-π的改变有关[2]。但乳腺癌尤其其耐药株对As2O3耐药与否至今仍然是相关研究领域的一个空白。本研究发现,0.5～16.0μmol/L的As2O3对MCF-7细胞均有生长抑制作用,其中,0.5～1.0μmol/L的As2O3抑制作用较弱,2.0～16.0 μmol/L的As2O3则显示明显的生长抑制作用,并随作用时间和作用浓度的增加而增强。可见,As2O3对MCF-7细胞有良好的增殖抑制作用,与文献报道一致。As2O3也能抑制MCF-7/ADR细胞的增殖,但细胞毒实验表明:(1)相同浓度As2O3对MCF-7/ADR细胞的抑制率明显低于其亲代MCF-7细胞,2.0μmol/L的 As2O3作用120 h两者的抑制率分别为 18.6%和40.1%;(2)MCF-7/ADR细胞96 h的IC50值高达12.8 μmol/L,显著高于其亲代 MCF-7细胞的3.0μmol/L;(3)8 μmol/L As2O3达到50%的抑制率,MCF-7/ADR细胞需要115.2 h,而 MCF-7细胞仅需 72.6 h,表明 As2O3对MCF-7/ADR细胞的起效时间晚于MCF-7细胞。可见,MCF-7/ADR细胞较其亲代MCF-7细胞对As2O3有耐药表现,耐药倍数为4.27倍。

耐药性是影响肿瘤患者化疗效果的重要因素,其中多药耐药是化疗失败的主要原因之一,多药耐药表型与许多因素有关,其中,Pgp、MRP1、GST过度表达是多药耐药的重要发病机制。随着近年来对As2O3耐药问题研究的深入,越来越多的研究结果表明高表达Pgp、MRP1和GST/GSH解毒酶系统的癌细胞可对As2O3产生有效的耐受。Vernhet等[3-4]以肺癌GLC4细胞和MRP1高表达的GLC4/Sb30细胞为研究对象,发现后者对亚砷酸盐、砷酸盐的耐药倍数分别是其母细胞(GLC4细胞)的12.7、16.3倍,同时,该细胞 MRP1的表达明显增加。Yang等[5]的研究发现对 As2O3敏感的膀胱癌、APL、胃癌细胞内谷胱甘肽浓度明显低于其他癌细胞,而对砷交叉耐药的多药耐药癌细胞较其敏感的亲代细胞往往含有较高的GSH水平。Liu等[6]则认为长期砷暴露的细胞通过过表达Pgp、MRP1/MRP2以及GST-Pi对砷产生获得性耐药。本实验中,用药前MCF-7细胞 Pgp、M RP1和GST的表达较MCF-7/ADR细胞弱,施加 As2O348 h后Pgp、MRP1和GST的表达增强也不明显;而MCF-7/ADR未用药前3者的表达均已较强,给药后更出现了 Pgp、MRP1的过表达以及GST活性的显著增加。推测这种差异正是造成MCF-7/ADR对As2O3耐药的原因,但何者在此过程中起了主导作用尚待进一步研究。

[1] 印国兵,吴诚义.砷剂对乳腺癌MCF-7和MCF-7/ADR细胞生长抑制作用的比较研究[J].重庆医科大学学报,2005,30:570.

[2] 王婷,双跃荣.三氧化二砷逆转入乳腺癌MCF-7/ADM细胞耐药的机制研究[J].中华肿瘤杂志,2002,24:339.

[3] Vernhet L,Allain N,Payen L,et al.Resistance of human multidrug resistance-associated protein 1 overexpressing lung tumor cells to the anticancer drug arsenic trioxide[J].Biocheical Pharmacology,2001,61(7):1387.

[4] Vernhet L,Seite MP,Allain N,et al.Arsenic induces expression of the multidrug resistance-associated protein 2(MRP2)genein primary rat and human hepatocytes[J].J Pharmacol Exp Ther,2001,298(1):234.

[5] Yang CH,Kuo ML,Chen JC,et al.Arsenic trioxide sensitivity is associated with low level of glutathione in cancer cells[J].Br JCancer,1999,81(5):796.

[6] Liu J,Chen H,Miller DS,et al.Overexpression of glutathione S-transferase II and multidrug resistance transport proteins is associated with acquired tolerance to inorganic arsenic[J].Mol Pharmacol,2001,60(2):302.