相思子毒素单克隆抗体的制备纯化及鉴定

张立营，赵怀龙，马凤龙，傅兴伦，孙英姿，高 波

相思子毒素是从豆科藤本植物相思子（Abrus precatorius）的种子中提取的一种剧毒性高分子蛋白毒素，其含量约占种子2.8%～3.0%。小鼠的LD50为0.04 μg/kg，成年人摄入的致死剂量为 5.0～7.0 μg/kg，其毒性强度是蓖麻毒素（小鼠LD503.0 μg/kg）的70多倍，已被列为潜在的重要毒素战剂和生物恐怖病原物质之一[1-4]。

国外已有报道恐怖分子用相思子毒素作为恐怖袭击的手段。美国陆军医学研究发展总部早在1991年对相思子毒素单克隆抗体进行研究和应用，而国内未见相关报道[5-8]。因此，无论是从国际生物武器核查角度，还是从防护目的，开展对相思子毒素的检测研究都具有十分重要的现实意义。

本实验应用相思子毒素毒蛋白免疫BALB/c小鼠制备了相思子毒素单克隆抗体，并对其进行了鉴定。拟为发展高灵敏度的相思子毒素检测试剂盒奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料 相思子毒素、蓖麻毒素、蒴莲根毒素、BALB/c小鼠、Sp2/0骨髓瘤细胞系由北京军事医学科学院微生物所提供。胎牛血清、1640培养基为Gibco公司产品；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂为Sigma公司产品；Protein A-Sepharose CL-4B为GE公司产品。

1.2 方法

1.2.1 BALB/c小鼠的抗原免疫 利用甲醛处理的相思子毒素毒蛋白作为抗原，经腹腔注射免疫10只雌性BALB/c小鼠。初次免疫用弗氏完全佐剂乳化的抗原，3周后用弗氏不完全佐剂乳化的抗原进行第2次免疫，再过3周同样用弗氏不完全佐剂乳化的抗原进行第3次免疫，3次免疫剂量均为100μg/只。每次免疫3次后后段尾静脉采血，用间接ELISA方法检测血清中的抗体效价，观测免疫效果。

1.2.2 杂交瘤细胞的建立 细胞融合前2d用抗原于小鼠尾静脉加强免疫1次，取小鼠脾细胞与Sp2/0细胞采用50%PEG2000融合按常规方法进行融合。

1.2.3 杂交瘤细胞的筛选与克隆 以10 μg/ml的相思子毒素为包被抗原，用ELISA方法，通过检测杂交瘤细胞的培养上清筛选阳性融合细胞，再对阳性孔中的细胞以有限稀释法进行3次细胞克隆，用抗体亚类测定试剂盒对克隆获得的杂交瘤细胞株进行抗体亚类鉴定。将经过抗体亚类鉴定的单克隆杂交瘤细胞株接种到预处理的BALB/c小鼠腹腔中，制备腹水，并测定其分泌单抗的稳定性。取生长良好，分泌稳定的杂交瘤细胞建株，扩大培养后入液氮保存。

1.2.4 单克隆抗体的效价测定 分别将用不同的单克隆杂交瘤细胞株诱生的小鼠腹水行1/100稀释，然后再以1/10稀释率进行梯度稀释；以相思子毒素为包被抗原，应用间接ELISA方法进行抗体的效价检测。

1.2.5 单克隆抗体的特异性鉴定 利用间接ELISA法，分别测定单抗与蓖麻毒素、蒴莲根毒素的交叉反应性。各种抗原按5 μg/ml的浓度包被96孔酶标板，同时设阴、阳性对照。

1.2.6 单克隆抗体的纯化 应用A蛋白亲和层析法纯化腹水中的单克隆抗体。将腹水先通过硫酸铵沉淀进行预处理，然后用ProteinA-Sepharose CL-4B亲和层析，通过AKTA explorer100监测纯化色谱图。

1.2.7 单克隆抗体的定量和SDS-PAGE鉴定 将纯化获得的单抗用BCA蛋白定量试剂盒测定抗体的浓度，并推算腹水中单抗的含量，并进行SDSPAGE鉴定

2 结 果

2.1 免疫效果分析 用间接ELISA法对免疫后的小鼠血清抗体效价检测表明，末次免疫小鼠血清抗体效价均在1∶8000以上，免疫效果良好，可以用于细胞融合。

2.2 杂交瘤细胞株的建立 通过对融合后的杂交瘤细胞培养上清进行检测和筛选，并对阳性孔中的细胞经过有限稀释法进行3次细胞克隆，结果显示细胞融合率为78%，其中阳性细胞孔为8个，阳性率为7.2%。对4株强阳性细胞株进行3次亚克隆后，得到4株单抗细胞株2D3、4E6、1C8和1E5。

2.3 单抗的亚类鉴定 根据抗体亚类测定试剂盒的方法， 分别用抗鼠 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA试剂包被96孔酶标板，测得2D3细胞株的亚类是 IgG1，4E6、1C8和 1E5细胞株的亚类均为Ig2b。

2.4 单抗的效价测定 用间接ELISA法分别对2D3、4E6、1C8和1E5杂交瘤细胞诱生的腹水进行效价测定，分别为 1∶1×107、1∶1×106、1∶1×105、1∶1×106。

2.5 单抗的特异性鉴定 利用间接ELISA法，分别测定单抗与蓖麻毒素、蒴莲根毒素的交叉反应性。结果表明，4株单抗与几种毒素均无交叉反应，说明所筛选出的单克隆抗体是特异的。

2.6 单克隆抗体的纯化 AKTA explorer100监测的纯化色谱图显示，2D3细胞诱生的腹水经蛋白A亲和层析纯化，获得了单一的蛋白洗脱峰（图1）。通过BCA蛋白定量试剂盒对纯化抗体进行定量测定，推算出腹水中单抗含量约为4.6 mg/ml。

图1 Protein A-Sepharose CL-4B层析图

2.7 单克隆抗体的SDS-PAGE鉴定 纯化的单抗进行还原性SDS-PAGE电泳，结果显示：5倍稀释腹水的SDS-PAGE结果为多条带，纯化后的IgG只有2条带，上下2条带分别为IgG的重链及轻链（图2），分子量分别是 50、26 kDa，与理论值相符合。

图2 纯化单抗的SDS-PAGE鉴定结果

3 讨 论

相思子毒素 （abrin）是存在于豆科植物相思（Abrus precatorius）种子中的一种毒蛋白，与蓖麻毒素（ricin）同为Ⅱ型核糖体失活蛋白（RIP）家族成员，是迄今为止所发现的毒性最强的植物毒素之一，毒性是普通化学武器的几百倍。从第一次世界大战起，经美、英、加、法等国的研究，相思子毒素已经成为一个成功的天然毒素战剂[9，10]。

相思子毒素天然资源比较丰富，制备比较容易，并且借助当今高度发达的生物工程技术手段，还能够实现大批量生产。相思子毒素中毒后无特异症状，出现症状时已经造成机体严重的器质性损害，给中毒的治疗及预防带来极大的难度，具备生物毒素武器典型特征，因此历来为外军所高度重视[3]。在2001年世界生物及毒素武器大会（BTWC）上，相思子毒素再次被列入重点核查清单，因此开展对相思子毒素的研究具有十分重要的意义[11，12]。

本研究利用相思子毒素免疫BALB/C小鼠制备了相思子毒素单克隆抗体，其与相思子毒素、蒴莲根毒素无交叉反应，表明此株单抗特异性较强，具备建立检测试剂盒的可能，可作为检测相思子毒素的核心试剂。

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