靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

卢 绩,陈岐辉,许 宁,王春喜,王晓庆,侯宇川,汪 岩

(吉林大学第一医院泌尿外科,吉林长春130021)

EZH2(enhancer of zeste homolog 2)基因是果蝇zeste基因增强子的人类同源基因,是Polycomb group(PcG)基因家族的重要成员之一。PcG蛋白控制着细胞的转录记忆系统,抑制转录,维持同源异型基因的失活状态[1],并参与细胞增殖的调控,许多PcG复合物已被证实在脊椎动物中起原癌基因或肿瘤抑制基因的作用[2]。本研究通过构建靶向EZH2基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,拟通过RNAi技术抑制EZH2基因的表达,从而为在基因水平探讨EZH2基因在肿瘤细胞中所起的作用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌DH5α由吉林大学公共卫生学院放射生物教研室保存并提供。真核表达载体pGenesil-2质粒购自武汉市晶赛生物工程技术有限公司。限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ及T4 DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒购自大连宝生物公司。小量质粒提取试剂盒购自中鼎公司。

1.2 方法

1.2.1 靶向EZH2基因的shRNA序列的设计 根据Genebank中EZH2基因的mRNA序列(Genbank accession no.NM-004456,NM-152998),采用Ambion 公司的网上设计软件(http://www.ambion.com),并参考shRNA的设计原则[3],设计两段靶向EZH2 mRNA的shRNA序列及一段不针对任何基因的阴性对照shRNA序列,并通过BLAST对所选择的靶序列进行同源分析,排除shRNA非特异性抑制其它基因片段的可能,最终确定shRNA序列。shRNA序列茎环结构为 9个与 EZH2基因不互补的非同源碱基(TTCAAGACG),即 Loop结构,末端终止子为TTTTTT,在合成的DNA片段末端设计SalⅠ酶切位点,并于整个shRNA结构两侧设计BamHI和HindⅢ酶切位点。设计的具有发夹结构的靶向EZH2基因的shRNA干扰片段序列如下:

以上DNA寡核苷酸单链均由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2 编码shRNA序列的单链寡核苷酸片段的退火连接。pGenesil-2载体的线性化(BamHⅠ+HindⅢ双酶切)。退火产物与线性化pGenesil-2质粒表达载体的连接。感受态细胞的制备采用CaCl2法。

1.2.3 连接产物转化感受态细胞 各取5 μ l过夜产物分别加入200 μ l感受态细胞DH5α中混匀,冰浴30 min,42℃水浴热休克90 s,迅速冰浴冷却3 min,再向其中加入800 μ l LB培养基,37℃摇床温育45 min使细菌复苏并表达质粒的Kana抗性标记基因。将菌液分别涂布于含Kana(终浓度30 μ g/ml)的 LB平板上,同时设立两个对照,即用未转化质粒的感受态细胞DH5α分别涂布与含同样浓度Kana的LB平板和不含抗生素的LB平板上,均放置于37℃恒温箱倒置培养过夜。从含Kana的LB平板上各挑取3个单克隆菌落接种于3 ml含Kana抗性(终浓度30 μ g/ml)的LB培养液中,37℃恒温摇床(250 rpm)培养过夜。

1.2.4 重组质粒的提取及酶切鉴定 收集上述培养菌液,用小提试剂盒(中鼎公司)参照质粒提取试剂盒提取步骤小量提取质粒。将提取得到的质粒用SalⅠ酶切 ,取质粒 DNA 1 μ l,10 ×H Buffer 1 μ l,SalⅠ1 μ l,去离子水7 μ l混匀,共 10 μ l反应体系,37℃水浴反应 3 h,取5 μ l反应产物在1%琼脂糖凝胶中电泳。

1.2.5 测序鉴定 为进一步验证重组质粒构建的准确性,经酶切鉴定后,将连接正确的重组质粒菌液送上海英骏生物技术有限公司进行测序。

2 结果

2.1 shRNA真核表达载体构建模式

重组质粒的结构图见图1。

2.2 pGenesil-2载体的线性化处理结果

pGenesil-2载体的线性化处理结果见图2。

2.3 重组质粒的酶切鉴定

重组质粒酶切电泳图见图3。在插入的目的基因片段里,我们设计了一个SalⅠ的酶切位点,插入在质粒pGenesil-2多克隆位点的BamHⅠ和HindⅢ之间,如果插入正确,应用SalⅠ酶切时,可切出一条约400 bp的DNA片段。从图中可以看出,pGenesil-2-EZH2-1,pGenesil-2-EZH2-2和阴性对照质粒都能够被SalⅠ酶切出一条约400 bp的小片段,而对应未进行酶切的样品则没有小片段,可以证明所设计的shRNA干扰片段确已插入到pGenesil-2质粒载体中。

2.4 重组质粒的测序分析

测序分析显示,在pGenesil-2-EZH2-1中,shRNA重组质粒终止信号6个T碱基可能因公司合成问题为5个T碱基,但根据RNAi原理,起关键作用的是与靶序列互补的siRNA反义链碱基,而5个T碱基亦能起到终止转录作用,因此该重组质粒质粒可以使用。其余重组质粒编码序列插入位置正确,无基因突变,与设计完全一致。

3 讨论

EZH2基因定位于人类染色体7q35,作为PcG蛋白家族的重要成员,其在维持同源盒基因(Hox)的转录抑制状态方面起关键作用,其中一个重要表现就是参与细胞增殖。最早提出EZH2参与细胞增殖是来自于观察到EZH2基因在增殖的外套淋巴细胞瘤细胞中优势表达,而在静止的细胞中则相反[4]。随后,陆续在前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等中都发现有EZH2基因高表达,而在其对应正常组织中则不表达或仅少量表达[5-8]。我们也在对国人膀胱癌组织中的EZH2基因表达情况进行了研究,发现随着膀胱癌分级及分期的提高,EZH2基因表达率上升,提示EZH2基因不仅可作为膀胱癌的一种新的癌基因和肿瘤标志物,其表达失调还可能与膀胱癌的恶性度和浸润性相关[9]。

图1 重组质粒结构示意图

图2 pGenesil-2载体的线性化处理后电泳图

图3 重组质粒酶切电泳图

siRNA是一种短片段双链RNA分子,能够以同源互补序列的mRNA为把目标降解特定的mRNA,因此在RNA干扰技术中,siRNA是关键。与抑制基因表达的传统工具,如反义寡核苷酸和核酶等比较,siRNA沉默基因的效率高达数十到数千倍。但是,虽然siRNA分子比单链的反义寡核苷酸要稳定,在体内仍会受到血浆中和细胞外液中核酸酶的降解,影响其长期的稳定性。shRNA即短发夹RNA,是含siRNA的正义和反义链的一段序列,中间以7个或9个碱基以形成环状,是siRNA的双链配对。shRNA在细胞内表达后可被Dicer切割茎环而产生双链siRNA。在这种情况下,携带靶向目的基因shRNA的载体就能够供给细胞大量的siRNA,并能分配到子代细胞中去,发挥更持久的RNA干扰作用。本研究构建的靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体使用U6启动子启动shRNA序列的转录,PolⅢ识别的终止信号终止转录,符合shRNA表达载体的设计要求。pGenesil-2载体的多克隆酶切位点中有一个SalⅠ酶切位点,我们在插入BamHⅠ和HindⅢ之间的shRNA片段中也设计了SalⅠ位点,这样,当片段插入正确时,就能被SalⅠ酶切出1条约400 bp大小的片段,经过酶切鉴定分析,构建的重组质粒酶切片段与预期大小一致,经测序分析发现,在pGenesil-2-EZH2-1中,shRNA重组质粒终止信号6个T碱基实际为5个T碱基,但5个T碱基亦能起到终止转录作用,而在RNA干扰中起关键作用的与靶序列互补的siRNA反义链碱基序列正确,证实构建成功。另外,本研究在构建重组质粒时采用了不含绿色荧光蛋白的pGenesil-2载体,在今后的RNA干扰实验中可以方便通过流式细胞仪进行Annexin V/PI双染进行细胞凋亡的检测,避免了质粒本身所含荧光可能带来的干扰。

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[9]卢 绩,王晓庆,芦志华,等.EZH2基因在膀胱移行细胞癌细胞株和癌组织标本中的表达及意义[J].中华泌尿外科杂志,2009,30(5):332.