微小RNA对心肌细胞C反应蛋白功能水平的调节

郭威早,佟 倩,曹立新,李 琳

(1.北京大学航天中心医院高干二科,北京100049;2.吉林大学第一医院心内科;3.安徽省六安市妇幼保健院检验科;4.中国医学科学院阜外心血管病医院心内科)

微小RNA(microRNA,简称miRNA)是人和其他生物体中内源性的短链RNA分子,长度为22核苷酸左右,其通过与相关的信使RNA(mRNA)结合抑制其翻译或诱发其降解[1]。研究显示,人类基因的30%受miRNA调节,此外miRNA的调节能力极强,单一的miRNA可以调控多达100-200个基因[2]。大量的研究证明,miRNA与心血管具有非常紧密的联系,这种联系的表现极为广泛,包括心脏的发育、损伤、修复,也包括各种心血管疾病,miRNA业已成为冠心病等心血管疾病分子病理学的研究热点[3]。

C反应蛋白(C-reactive protein,简称CRP)是心血管疾病中最具代表性的信号分子之一,也是现代心血管疾病研究的焦点之一。离体和在体的研究显示,CRP能够识别宿主体内特定的外来病源以及受损的细胞,与血液中的体液及细胞效应机制相互作用,从而启动对病源和受损细胞的清除[4]。由此可见,CRP既具有识别功能,又兼备效应能力,其重要性非同一般。本研究将微小RNA和C反应蛋白结合起来,探讨miRNA对CRP的调节。

1 材料与方法

1.1 大鼠心肌细胞培养 大鼠心肌细胞H9c2(2-1)由美国ATCC公司购买,获得细胞株之后,采用 DMEM培养基加10%胎牛血清,在 5%CO2,37℃条件下培养。一轮培养 3天,然后按1∶2-4的比例分盘继续培养,细胞脱壁收集采用0.25%(重量/体积)胰蛋白酶合并0.53 mM EDTA溶液处理10分钟。

1.2 调控CRP之miRNA的选择 miRNA与调控靶基因之间不存在精确的对应关系,一个miRNA可以调控数十个甚至更多的基因,同时,一个基因也可以被数十个乃至更多的miRNA调控。因此,选择一个基因的调控miRNA需要多层次,多角度的分析。在本研究中,我们首先根据国际通行的理论预测方法[5]对大鼠C反应蛋白基因3'端非转录区(UTR)进行推测,以“种子区”(seed)完全匹配为筛选标准,获得21个候选miRNA,对大量的既往研究报道进行了对比分析后,最后锁定了miR-132。miR-132除了根据理论推测调控CRP之外,研究显示,其在机体应激反应和白细胞介素-8(il-8)的调节中具有重要作用[6]。应激反应和il-8均与心血管疾病有密切的联系,由此进一步佐证了miR-132极有可能介入心血管疾病的调节。

1.3 miR-132的增强和抑制 增强剂和抑制剂均从美国Ambion公司(现为美国ABI公司所属)。PremiR miRNA前体为合成的双链RNA分子(针对miR-132的产品号为PM10166),因模拟自然产生的miR-132的功能而产生增强效应;Anti-miR miRNA抑制剂为化学修饰的单链核酸(针对miR-132的产品号为AM10166),可以特异地结合miRNA而产生抑制效应。此外Pre-miR miRNA前体分子阴性对照1号(产品号:AM17110)和Anti-miR miRNA抑制剂阴性对照1号(产品号:AM17010)分别作为增强剂和抑制剂的阴性对照。

1.4 细胞转染 为了将miR-132增强剂、抑制剂及其相应阴性对照导入培养的H9c2(2-1)大鼠心肌细胞,实验采用美国Neuromics公司iFect试剂盒,操作按照产品说明书进行。预实验采用了4个浓度,分别为10、20、30及40 nmol/L,正式实验按最小有效剂量原则(尽可能减少转染试剂对细胞的毒副作用)采用20 nmol/L。细胞在转染后状态继续培养48 h。

1.5 蛋白免疫印迹杂交 通过1000 g,10 min离心收集培养细胞。将细胞沉淀重悬于1 ml冰冷的裂解缓冲液,转移至2.0 ml Eppendorf离心管中。裂解缓冲液包括:20 mM Tris-HCl(pH7.5),1 mM EDTA,1 mM EGTA,2.5 mM焦磷酸钠,1%Triton X-100,150 mM氯化钠,1 mM β-磷酸甘油。以下成分在使用前加入:5 mM二硫苏糖醇,1%磷酸酶抑制剂Cocktail I,1%磷酸酶抑制剂Cocktail II,10%磷酸酶抑制剂Cocktail(磷酸酶抑制剂购自Sigma公司)。样本通过Virtis超声细胞粉碎仪进行超声剪切(设置2.0,处理1 s×10次),然后,样本在14 000 g离心 5 min去除不溶性沉渣。蛋白浓度测定采用Pierce公司BCA蛋白试剂盒进行。免疫印迹用处在线性区间的蛋白量进行。等量的蛋白加入到8-16%SDS-PAGE进行电泳分离然后电转移至硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜上的非特异结合通过以下杂交液屏蔽。杂交液包括Tris缓冲盐水,0.1%吐温-20,5%脱脂牛奶。CRP抗体(美国Abcam公司)根据制造者的建议稀释并根据初始测试调整,正式实验中采用1∶200的比例稀释。次级抗体为辣根过氧化物酶耦联的抗兔抗体。β-肌动蛋白抗体(美国Cell Signaling公司)用作上样对照。免疫复合物用ECL加强型试剂盒(美国Amersham公司)探测。免疫印迹的定量分析采用Syngene G:BOX凝胶建档及分析系统(英国Syngene公司)进行。

1.6 统计分析

统计检验用SPSS 11.5版进行。资料收集,一般统计计算(均值、标准差、标准误等)以及统计作图采用微软公司MS-Excel(version 2000)。

2 结果

2.1 大鼠心肌细胞H9c2(2-1)培养 在本研究所设定的培养条件下,大鼠心肌细胞株H9c2(2-1)生长状况正常,无异常分化,形态符合大鼠细胞的一般组织学特征(见图1)。

图1 培养中的大鼠心肌细胞H9c2(2-1)(倒置显微镜 100×观察)

2.2 miR-132的增强和抑制对CRP蛋白表达水平的影响 培养中的大鼠心肌细胞株H9c2(2-1)在运用增强剂Pre-miR-132处理48 h后,CRP蛋白水平与阴性对照相比,出现了明显的下降(t-检验,P=0.013 21)。与此同时,大鼠心肌细胞株H9c2(2-1)在运用抑制剂Anti-miR-132处理48小时后,CRP蛋白水平与阴性对照相比,出现了明显的上升(t-检验,P=0.012 40)。作为本实验蛋白印迹杂交的上样内参照,β-肌动蛋白的水平没有显著差异。miR-132的增强和抑制实验采用6孔细胞培养板进行,每对处理-对照均在同一细胞培养板上进行,确保培养和处理条件的完全一致。miR-132增强和抑制实验分别进行了6对比较(n=6)。miR-132的增强和抑制结果详情参见图2。

图2 miR-132增强剂和抑制剂对CRP蛋白质水平的影响

3 讨论

在冠心病的病理学说中,C反应蛋白居于重要的核心地位[7],国内外均对这一标志性蛋白分子进行了大量的研究。迄今为止的研究绝大多数CRP本身的量化测定以及与疾病的相关,很少涉及CRP背后的分子调控机制。心血管病具有非常复杂的背景,在CRP的背后存在众多复杂的因素及这些因素之间的相互作用,这种复杂的背景在很大程度上阻碍了对CRP分子调节机制的研究。近年来关于miRNA认识的深入为心血管疾病的分子机制研究提供了新的途径,也为重新认识CRP的基因调控提供了新的手段。

本研究以大鼠心肌细胞为研究对象,在具有潜在调节功能的miRNA功能增强和抑制的条件下观察CRP蛋白的水平,旨在建立miRNA与CRP基因功能水平二者之间的关系。本研究经过系列的分析筛选,通过理论推测和参考研究报道选择了miR-132。研究显示,miR-132可以调节应激反应,并可以调节细胞因子白细胞介素-8的水平[6]。值得关注的是,应激被大量的研究证实为冠心病的危险因素[8,9],而IL-8与冠心病的联系也具有明确的研究支持[10]。

我们的研究观察在很大程度上证实了理论上的预计。采用miR-132增强处理可以显著抑制心肌细胞CRP蛋白水平,说明miR-132对CRP基因的功能水平具有抑制调节功能。与此相对应,采用miR-132抑制处理可以显著提高心肌细胞CRP蛋白水平,说明miR-132功能部分或全部丧失的情况下,CRP的基因功能水平可以大幅度的提高。研究提示,在心血管疾病的分子病理学方面,miRNA是一个不可忽视的重要调控因素。

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