薯蓣皂苷元对人胃癌SGC-7901细胞体外作用的研究

何忠梅,白 冰,金 颖,祝洪艳,阚俊明,宋 宇

(1.吉林农业大学中药材学院,吉林长春130116;2.吉林大学畜牧兽医学院;3.吉林修正药业新药开发有限公司;4.长春中医药大学)

薯蓣皂苷元(Diosgenin,Dio)是从我国特有的薯蓣科植物穿龙薯蓣Dioscorea nipponicaMakino中分离得到的一种植物甾体化合物,具有降血脂、降血糖、促进胆汁分泌、抗心肌缺血、抗风湿、抗炎等作用,而它的抗肿瘤作用[1,2]更是引起了研究者的极大关注。我们课题组曾报道Dio对小鼠肉瘤S180、肝癌腹水型HepA、小鼠宫颈癌U14和艾氏腹水癌EAC的体内抗肿瘤作用,并观察了离体条件下Dio对人乳腺癌细胞MCF-7、小鼠纤维细胞L929、黑色素瘤细胞A375-S2、人宫颈癌细胞HeLa、人胃低分化粘液腺癌MGC-803等细胞株的作用[3-5]。但其对人胃癌SGC-7901细胞的作用情况及其作用机制尚无相关报道,本研究考察了Dio对SGC-7901细胞的增殖、细胞周期以及细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 人胃癌细胞株SGC-7901购于吉林省肿瘤医院。RPMI-1640培养基,薯蓣皂苷元,二甲基亚砜均购自美国Sigma公司。胎牛血清为长春生物制品研究所产品。胰蛋白酶为日本生产上海化学试剂厂分装。5-氟尿嘧啶(5-FU,批号20090612)购于上海锐聪科技发展有限公司(购于美国Sigma公司)。PBS、四甲基偶氮唑盐(MTT)购自北京鼎国生物技术公司。

1.2 细胞培养 将SGC-7901细胞接种于含10%胎牛血清、100 U/ml青、链霉素的RPMI-1640培养液中,放入37℃、5%CO2培养箱培养,待细胞进入对数生长期后用0.25%胰蛋白酶消化传代培养。

1.3 MTT法测定薯蓣皂苷元对人胃癌细胞株SGC-7901增殖的影响 将细胞以1×105个/ml浓度接种于96孔培养板(100 μ l/孔)中,待细胞贴壁后,实验组分别加入100 μ l不同浓度的薯蓣皂苷元培养液,使最终浓度分别为2、4 、8 、16、32 、64、128 μ g◦ml-1,阳性对照组加入5-氟尿嘧啶,终浓度为20 μ g◦ml-1,阴性对照组加入含0.5%DMSO的培养液100 μ l/孔,空白对照组加入等体积的培养液,每组各设4个平行孔。37℃,分别培养 24、48、72 h,加入5 mg/ml MTT 20 μ l,继续培养4 h,弃上清,每孔加入DMSO 150 μ l,混匀,酶标仪(λ=570 nm)测定吸光度(A570),按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率[6]:肿瘤细胞生长抑制率(%)=[1-A570(实验组)/A570(对照组)]×100%。

1.4 薯蓣皂苷元对人胃癌细胞株SGC-7901生长半数抑制浓度IC50的计算 直线回归法[7]:当细胞生长抑制率与药物浓度有对数关系时,以药物的对数浓度为横坐标,相应的细胞生长抑制率为纵坐标,求出直线回归方程,根据该方程计算出IC50。

1.5 流式细胞仪测定薯蓣皂苷元对人胃癌细胞株SGC-7901细胞周期和细胞凋亡的影响 SGC-7901细胞单层接种在60 mm×15 mm的培养皿中,细胞数为1×106个,培养24 h后加入不同浓度的薯蓣皂苷元培养液 ,使最终浓度分别为 8、16、32、64 μ g◦ml-1,同时设阴性对照组,每组设4个平行,分别培养0、12、24 、36 h 后,收集贴壁及悬浮细胞,1 500 r◦min-1离心 5 min,PBS(0.01 mol◦L-1,Ph7.4)洗 1次 ,70%冰乙醇-20℃固定18 h,用冷PBS洗2次,1 500 r◦min-1离心 5 min,弃上清,悬于 0.5 ml含 50 g◦L-1PI,100 mg◦L-1RNase A 的染液中,4℃避光染色30 min。500 mm筛网过滤后,用流式细胞仪FACSCalibur(美国BD公司)测定,计算机软件处理,得出各细胞周期及凋亡细胞百分比。

1.6 统计学处理 计量资料以均数±标准差表示,多组均数间比较用F检验,两组间均数差异以SPSS统计软件进行t检验。

2 实验结果

2.1 薯蓣皂苷元对人胃癌细胞株SGC-7901增殖的抑制作用 Dio对人胃癌SGC-7901细胞增殖具有明显的抑制作用,且呈明显的时-效和量-效关系。随着Dio浓度的增加,作用时间的延长,其抑制SGC-7901细胞增殖的能力也随之增强。经SPSS软件统计,Dio对SGC-7901细胞的生长抑制率与药物浓度成对数关系,故采用直线回归方程法计算IC50值,Dio作用SGC-7901 细胞 24、48、72 h IC50值分别为62.90、31.83 和 18.21 μ g◦ml-1。当 Dio 达到较高浓度(32、64 μ g◦ml-1)时,对 SGC-7901 细胞的增殖抑制作用在48、72 h已十分接近。因此,48 h高浓度Dio已基本发挥最大效能,结果见表1。

表1 薯蓣皂苷元对人胃癌细胞株 SGC-7901增殖的抑制作用(±s,n=4)

表1 薯蓣皂苷元对人胃癌细胞株 SGC-7901增殖的抑制作用(±s,n=4)

与阴性对照组比较*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001

组别 浓度(μ g◦ml-1)作用24 h平均A570(抑制率%)作用48 h平均A570(抑制率%)作用72 h平均A570(抑制率%)阴性对照组 0 0.739±0.016 0.813±0.013 0.935±0.011 5-FU 20 0.398±0.008***(46.08) 0.266±0.010***(67.16) 0.132±0.007***(85.85)薯蓣皂苷元 2 0.699±0.012(5.41) 0.764±0.013(6.03) 0.872±0.008*(6.77)4 0.685±0.007*(7.31) 0.732±0.013*(9.96) 0.830±0.012*(11.24)8 0.616±0.011*(16.64) 0.663±0.012*(18.45) 0.751±0.008**(19.64)16 0.529±0.010**(28.42) 0.537±0.009**(33.94) 0.610±0.007***(34.73)32 0.431±0.016**(41.68) 0.439±0.011**(46.00) 0.503±0.010***(46.19)64 0.210±0.009***(71.58) 0.199±0.010***(75.52) 0.224±0.006***(76.02)128 0.163±0.009***(77.94) 0.151±0.009***(81.43) 0.164±0.005***(82.40)

2.2 薯蓣皂苷元对人胃癌SGC-7901细胞周期及凋亡的影响 应用FACS ModFit LT软件对流式细胞仪检测数据进行分析,使RCS(统计学指标,用来反映所选定的模式与标本的拟合程度)小于等于5.0,分析得到Dio对人胃癌SGC-7901细胞作用的细胞周期时相和凋亡率数据。细胞周期数据显示,Dio在较低浓度 8和16 μ g◦ml-1时,随着作用时间由12-24-36 h延长,对人胃癌SGC-7901细胞周期(G0/G1,S,G2/M)均没有影响;当Dio浓度增加到32和64 μ g◦ml-1时,随着作用时间的延长S期细胞略有增加,G2/M期细胞略有减少,但与阴性对照组比较差异不显著。凋亡数据表明,随着作用浓度由8-16-32-64 μ g◦ml-1的不断增加 ,随着作用时间由 12-24-36 h的不断延长,Dio诱导人胃癌SGC-7901细胞的凋亡率不断增加,呈现较好的时间-剂量依赖性。具体结果见表2。

表2 薯蓣皂苷元对人胃癌 SGC-7901细胞周期和细胞凋亡的影响(±s,n=4)

表2 薯蓣皂苷元对人胃癌 SGC-7901细胞周期和细胞凋亡的影响(±s,n=4)

与阴性对照组比较*P＜0.05,**P＜0.01

作用时间(h) 薯蓣皂苷元浓度(μ g◦ml-1) G0/G1期(%) G2/M 期(%) S期(%) AP(%)12 阴性对照 21.32±2.21 34.67±3.83 42.28±6.32 1.48±0.62 8 23.14±3.34 36.93±4.05 43.22±5.22 7.69±1.23 16 22.26±5.65 34.75±3.27 41.45±7.81 12.84±0.84*32 20.38±4.89 35.81±6.48 40.34±6.12 27.12±2.32**64 19.57±6.48 33.20±5.39 41.27±5.38 30.08±1.97**24 阴性对照 16.28±1.93 52.03±7.69 29.28±2.46 2.31±0.85 8 17.36±3.22 53.96±4.62 30.92±5.25 10.43±1.69*16 15.84±2.18 51.37±5.61 29.32±4.66 15.69±1.33*32 16.32±2.97 46.69±4.23 34.62±5.44 31.23±2.77**64 17.68±2.21 44.12±5.21 38.02±4.97 38.83±4.74**36 阴性对照 31.63±5.27 35.82±4.24 28.29±3.99 4.28±1.06 8 32.13±4.38 36.10±4.12 27.34±5.18 12.39±1.02*16 31.34±5.01 35.65±3.98 28.67±4.12 18.81±1.24*32 33.26±4.58 30.91±9.21 33.82±5.39 37.21±2.94**64 32.23±5.99 24.22±10.89 39.23±4.28 43.78±3.99**

3 讨论

我们的实验证实,薯蓣皂苷经口服后被肠内菌代谢为Dio吸收入血[8],Dio具有很好的体内和体外抗肿瘤作用[3-5],更重要的一点是Dio无毒副作用,因此将Dio开发为临床抗肿瘤药物有很大的发展前景。药代动力学实验表明Dio吸收入血后主要分布在胃肠壁,因此本实验探讨Dio对人胃癌细胞SGC-7901的抑制作用,并考察其对SGC-7901细胞周期和细胞凋亡的影响。

MTT结果显示,Dio体外可抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖,并呈时间-剂量依赖性,作用 24、48、72 h的半数抑制浓度(IC50)分别为62.90、31.83和18.21 μ g◦ml-1;流式细胞检测表明,8 、16、32、64 μ g◦ml-1的Dio分别作用 SGC-7901 细胞 12、24、36 h,对细胞周期没有明显影响,但能明显诱导SGC-7901细胞发生凋亡,同样具有显著的时间-剂量依赖性。本实验提供了Dio抑制SGC-7901细胞生长的可能机制,为Dio用于临床治疗胃癌提供了一定的实验依据。

[1]Shabbeer S,Sobolewski M,Anchoori R K,et al.Fenugreek a naturally occurring edible spice as an anticancer agent[J].Cancer Biology&Therapy,2009,8(3):268.

[2]Raju J,Mehta R.Cancer chemopreventive and therapeutic effects of diosgenin,a food saponin[J].Nutrition and Cancer-an International Journal,2009,61(1):27.

[3]王丽娟,王 岩,陈声武,等.薯蓣皂苷元体内、外的抗肿瘤作用[J].中国中药杂志,2002,27(10):777.

[4]宋 宇,梁长青,何忠梅,等.薯蓣皂苷元体外抗肿瘤作用的研究[J].中国肿瘤,2004,13(10):651.

[5]李晶华,李春爱,霍 锐,等.薯蓣皂苷元对人低分化胃腺癌细胞株生长的抑制作用[J].吉林大学学报(医学版),2004,30(2):198.

[6]梁 洁,甄汉深,王新盛.美味猕猴桃根中三萜类化合物的体外抗肿瘤实验研究[J].中药材,2009,32(6):959.

[7]王天山,陆跃鸣,马国祥.鼓槌石斛中化学成分对K562肿瘤细胞株生长抑制作用体外实验[J].天然产物研究与开发,1997,9(2):1.

[8]马海英,周秋丽,王本祥.黄山药总皂苷肠内菌代谢及代谢产物吸收的研究[J].中国药房,2002,13(4):204.