碱性成纤维细胞生长因子对猪急性心肌梗死血管新生的意义

张洪宇,董明慧,张文琪,李树岩

(1.大安市医院内科二疗区,吉林 大安131300;2.长春市中心医院;3.吉林大学白求恩第二医院)

近年来血管生长因子在急性心肌梗死治疗领域的应用受到人们的关注,在众多生长因子当中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)因其具有促进血管新生的生物学特性而备受瞩目。bFGF基因位于人类第5号染色体上,为单拷贝基因,由3个外显子和2个内含子组成。bFGF由146个氨基酸组成,分子量约为17.86 kD,对热和酸敏感,易被蛋白酶降解,与肝素有特异性亲和力[1]。bFGF在体内分布极为广泛,脑 、心 、肝 、肾 、肾上腺 、骨 、眼和胎盘等都有它的存在。在心血管系统中,血管内皮细胞、心肌细胞和平滑肌细胞均有合成bFGF的能力。而bFGF可以直接作用于成纤维细胞、内皮细胞,促进其分化、增殖、迁移形成向血管[2-4]。国内外均有研究报道,对于急性心肌梗死,短期内补充bFGF,有利于梗死区血管新生,进而改善梗死区域的血流灌注,挽救濒死或顿抑的心肌。本实验研究旨在探讨经导管向心肌梗死区域灌注bFGF基因重组腺病毒对心肌梗死区血管新生的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料

8-12个月龄的小型猪12只,由吉林大学实验动物基地提供。bFGF重组腺病毒表达载体。Ⅷ因子相关抗原抗体系列、SP试剂盒、DAB显色剂(北京新华宇生物技术有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 球囊堵闭法建立小型猪急性心肌梗死动物模型 12只实验动物手术前三日给予阿司匹林100 mg/日,术前禁食 12 h,禁饮4 h,沐浴后称重,安定10 mg、氯胺酮10 mg/kg肌注,于小型猪耳静脉用静脉套管针建立静脉通路,以0.9%盐水维持静脉通路,同时给予速眠新0.25 ml/kg肌注,阿托品1 mg肌注。将小型猪移至导管床上,取仰卧位,胸部、腹股沟区及四肢用8%硫化钠去毛后,用针电极连接胸部及四肢导联,记录心电图。常规消毒铺巾,分离右侧股动脉,结扎远心端。经右侧股动脉置入6F动脉鞘管并给肝素5000 U,以后每隔1 h追加肝素1000 U。经股动脉径路以左、右冠状动脉造影导管分别行左/右冠状动脉造影,观察猪冠状动脉的分布情况。然后选用左冠指引导管到达左冠状动脉开口后,送入冠脉导丝至前降支远端,根据造影结果选择球囊(血管/球囊比率为1∶1.05)在导丝指引下置入2.0 mm×15mm或2.5 mm×15 mm球囊至第一对角支以远1 cm处,以3-4atm充盈球囊20 s/次,反复 3-4次,间隔3-5 min进行预适应。然后以8-10atm打开球囊堵闭左前降支(LAD)中远段,造影显示球囊远端前降支血流中断,15 min后撤除球囊及鞘管,结扎血管,逐层缝合包扎。术中予连续心电监护,并于术前、术中、术后 6、12、24小时抽静脉血测 CKMb。

1.2.2 实验动物分组 将实验动物随机分为两组。组Ⅰ:bFGF基因治疗组(n=6)。用微球囊导管送至梗死相关冠脉,扩张球囊并注射含有bFGF重组腺病毒表达载体的PS缓冲液5 ml;组Ⅱ:心肌梗死对照组(n=4)。通过微球囊导管送至梗死相关冠脉并灌注无血清DMEM培养液5 ml。术后4周通过观察冠状动脉造影及免疫组化法标测Ⅷ因子内皮细胞特异标记,观察心肌梗死区新生血管数量。

1.3 统计学处理

采用SPSS10.0统计软件,计量资料以均数±标准差表示,采用方差分析证明各组方差齐性后采用LSD-t检验,以P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

12只猪均成功完成冠状动脉造影,球囊成功导入前降支远端,制模2周后共有10只小型猪成活。2头失败模型中,1头于冠状动脉LAD内微球囊加压过程中诱发室颤死亡,另外1头制模后急性左心衰发作猝死,术中、术后不同时间描记心电图及CKMB变化均证实猪心肌梗死模型成功。

2.2 bFGF基因治疗后冠状动脉造影检查结果

两组实验动物在成模2周后基因治疗前行冠状动脉造影证实前降支远端完全闭塞,同时通过采用Rentrop计分法[5](侧支循环指数),判断各组治疗后缺血区灌注及心功能改善情况。基因治疗前2组Rentrop评分无明显差异。基因治疗4周后冠状动脉造影检查可见:组Ⅰ实验动物的LAD及其分支充盈均有明显改善,局部可见不同程度的侧支充盈:组Ⅱ动物未见显著侧枝血管形成。治疗后Rentrop分数组Ⅰ较组Ⅱ有显著性提高(P＜0.01)。

表1 治疗后 Rentrop评分情况(±s)

表1 治疗后 Rentrop评分情况(±s)

治疗后Rentrop分数,组Ⅰ与组Ⅱ比较,P＜0.01

组别 例数 治疗后Rertop评分Ⅰ2.32±0.56Ⅱ4 1.00±0.27 6

2.3 免疫组化法鉴定梗死区新生血管情况

基因治疗4周后,处死动物取心脏标本可见左心室前壁近心尖部分色泽苍白,显示心肌有缺血和梗死。取梗死区心肌标本切片行免疫组化法标测Ⅷ因子内皮细胞特异标记,结果显示:组Ⅰ心肌梗死区内部有明显血管新生(22.4±2.3个MPF),血管多分布于移植细胞和残存心肌细胞之间,边缘区多于梗死区,排列整齐,呈芽枝状伸向梗死中心。毛细血管管壁较薄,无平滑肌,由一层内皮细胞构成(见图1)。组Ⅱ无明显血管新生(3.9±1.2个MPF)(见图2)。正常心肌内无血管新生。

图1 hbFGH组VⅢ因子染色阳性的移植区域×400

表2 基因治疗4周后新生血管密度(±s)

表2 基因治疗4周后新生血管密度(±s)

注:实验组间比较 P＜0.01

组别 例数 新生血管密度(个/HPF)Ⅰ22.4±2.3Ⅱ4 3.9±1.2 6

图2 MI对照组染色呈阴性×400

3 讨论

自1993年Hoekel提出了治疗性血管生成[6]的概念后,利用生长因子来促进缺血组织的血管新生越来越受到人们的重视,同时也为急性心肌梗死的治疗揭示了新的篇章。较多的实验研究证实:bFGF治疗缺血性心脏病是可行、有效和安全的。Unger等在左冠状动脉回旋支狭窄模型中发现,在狭窄动脉支配区心肌内注射bFGF,侧支循环血流量和内皮细胞DNA合成增加。并且认为bFGF改善心肌缺血的作用得益于侧枝循环的形成[7]。Schumache等1998年首次报道了bFCF的临床应用:入选40例多只病变并接受冠脉搭桥的患者,治疗组20例于IMA/LAD吻合口远端靠近LAD处心肌局部注射bFGF,平均用量0.01 mg/kg;对照组20例于相同条件下注射热灭活bFGF。12周后行冠状动脉造影及搭桥血管数字减影血管造影。结果显示治疗组其注射部位及以远端LAD供血区有明显新生血管,所有受试者注射bFGF的心肌部位均出现毛细血管网,从LAD近端伸出,延伸到周围心肌,使周围的血供增加了近3倍,所有患者冠状动脉造影都没有肉眼可辨的新狭窄形成[8]。在国内蒙艳斌等将bFGF联合胚胎干细胞D3株(ES-D3)局部注射于大鼠心肌梗死区域,移植后4周,bFGF+ES-D3移植组大鼠心肌梗死瘢痕区毛细血管密度显著高于单用ES-D3移植组。表明ES-D3移植同时联用bFGF使大鼠心肌梗死后血管新生增加[9]。

本实验通过球囊堵闭法成功建立了小型猪急性心肌梗死模型,证实了该方法建立的动物模型成功率高,动物创伤小,存活时间长。本实验经导管将bFGF基因重组腺病毒表达载体注入梗死区域,探讨了bFGF基因治疗对猪急性心肌梗死血管新生的作用。在基因治疗4周后我们对两组动物行冠状动脉造影结果进行了比较:组I实验动物的LAD及其分支充盈均有明显改善,局部可见不同程度的侧支充盈:组Ⅱ未见显著侧枝血管形成。Rentrop分数组Ⅰ较组Ⅱ有显著性提高(P＜0.01)。同时我们对梗死区心肌标本进行了Ⅷ因子相关抗原的免疫组化检测。Ⅷ因子相关抗原位于内皮细胞的weibel-palada小体上,抗Ⅷ因子的抗体是最特异的内皮细胞标记物,能较好的显示组织中的小动脉、小静脉和毛细血管,因此Ⅷ因子相关抗原抗体复合物的免疫组化染色常作为反应血管生成的间接手段。实验结果显示:组Ⅰ心肌梗死区内部有明显血管新生(22.4±2.3个MPF),而组Ⅱ无明显血管新生。可以证明bFGF有促新生血管作用。目前认为bFGF促进血管新生的机制如下:(1)bFGF可以促进血管内皮细胞的增殖、迁移、形成官腔。(2)bFGF能够引起NO合酶表达上使内皮细胞NO的释放增多,导致内皮依赖性舒血管反应,使潜在的侧支循环开放[10]。(3)bFGF的血管生成作用有一部分是通过调节VEGF表达及生成来实现[11]。

[1]Rifkin DB,Moseatelli D.Recent developments in the cell biology of basic fibroblast growth faetor[J].J Cell Biol,1989,109(1):1.

[2]Scott RJ,Morrow LA.Growth factors and angiogensis[J].Cardiovasc Res,1993.27(7):1155.

[3]石 缨,温进坤.碱性成纤维细胞生长因子,新生小牛血清和肝素对大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响[J].中国动脉硬化杂志,1998,6(3):189.

[4]欧大明,刘革修,刘江华,等.碱性成纤维细胞生长因子反义寡脱氧核酸抑制胰岛素诱导动脉平滑肌细胞增殖[J].中国动脉硬化杂志,1999,7(2):99.

[5]Rentrop KP,CohenM,Blanke H,et at Changes in collateral Channel tilling innediately after controlled coronary artery occlusion by anAngioplasty ballon in human subjects[J].J Am Coll Cardiol,1985,5:587-592.

[6]Hoekel M,Sehlenger K,Doetrow S,et al.TheraPeutic angiogenesis[J].Arch Surg,1993,128(4):423.

[7]UngerEF,Banai S,ShouM,et al.Basic fibroblast growth factor en-hances myocardial collateral flow in a canine model[J].Am J Physiol,1994,266(4Pt2):1588.

[8]Schumacher B,Pecher P,Von Specht BU,et al.Indution of a Neoangionenesls in Ischemic myocardium by Human Growth factors:Firsf clinical results of a New treatment of coronary Heart Disease[J].Circulation,1998,97:645.

[9]蒙艳斌,潘爱华,贺莉萍,等.胚胎干细胞联合碱性成纤维细胞生长因子移植对大鼠急性心肌梗死的影响[J].解剖学报,2008,39(1):88.

[10]Murohara T,Asahara T,Silver M,et al.Nitric oxide synthase modulates angiogenesis in response to tissue ischemia[J].J Clin Invest,1998,101:2567.

[11]李树岩,回学军,纪 磊,等.FGF重组腺病毒转染骨髓间充质干细胞促进VEGF的表达[J].中国老年学杂志,2007,27(22):2171.