虎眼万年青总皂苷中单体皂苷的分离纯化

孙 亚 娟， 金 凤 燮， 鱼 红 闪

( 大连工业大学 生物与食品工程学院， 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

虎眼万年青(Ornithogalum caudatum Ait)是一种极具开发潜力的中草药。虎眼万年青中所包含的虎眼万年青皂苷属于甾体皂苷，甾体皂苷具有广泛的药理作用和重要的生物活性，如抗肿瘤、抗真菌、防治心血管疾病、降血糖、免疫调节等。虎眼万年青皂苷OSW-1，是一种具有极强抗癌活性的酰基胆甾烷苷，对肺癌、乳腺癌有明显的抗癌活性。体外抗p338淋巴细胞白血病活性结果表明，OSW-1是常见抗癌药物喜树碱、阿霉素、紫杉醇抗癌活性的10～100倍[1]，而且对正常细胞没有毒性。迄今为止，国内对虎眼万年青的研究，主要集中在多糖的提取及药理活性[2-4]和组织培养方向[5]，对于虎眼万年青皂苷的分离提取的报道很少。本实验室肖冲等[6]已从虎眼万年青中提取了虎眼万年青皂苷，由于单体皂苷作用不同，所以有必要制成单体皂苷制剂。本实验以分离得到虎眼万年青皂苷单体组分为首要目的，用硅胶柱层析法尝试分离虎眼万年青皂苷单体组分。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

虎眼万年青总皂苷，实验室自制；硅胶，青岛海洋化工厂；薄层层析板(TLC)，德国Merck公司生产；旋转蒸发仪，上海爱郎仪器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 薄层层析(TLC)

本实验所用薄层层析板由德国Merck公司生产。用微量取样器取一定量样品点于薄层层析板起始线上，电吹风吹干，置于放好展开剂的展开缸中展开后，吹干溶剂，10% H2SO4溶液显色，得TLC图谱。所用展开剂为：V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7.0∶3.0∶0.5。

1.2.2 减压硅胶柱层析

制备样品胶：称取一定量的虎眼万年青总皂苷放入瓷碗中，加入适量的甲醇，充分溶解后，与1.5倍样品质量的80～100目硅胶混合，搅拌均匀，60 ℃水浴锅上加热，待样品被硅胶吸附，溶剂充分挥发干燥后，磨成均匀的粉末，样品胶制备完成。

装柱：先用一小块脱脂棉堵住柱底，然后取16倍样品质量的300～400目硅胶(分离胶)装柱，保持水平，抽真空压实，然后在其上面装入薄薄一层80～100目的硅胶，再装入干燥好的样品胶，最后在样品胶上面铺上一层脱脂棉，抽真空压实。

硅胶柱装好后，先用纯氯仿通柱子，再用氯仿-甲醇的混合溶剂进行洗脱，每次大约100 mL，分别收集洗脱液。用薄层层析法跟踪检测整个洗脱过程，根据硅胶板上显示的结果，把具有相同组分的洗脱液收集在一起，浓缩得固体产物。

本实验虎眼万年青总皂苷用量为5 g，洗脱液比例为V(氯仿)∶V(甲醇)=9∶1。

1.2.3 超高压液相色谱检测虎眼万年青皂苷

实验所用为美国Waters Acquity UPLC色谱仪；C18色谱柱为waters 50 mm×2.1 mm，1.7 μm；进样量为3 μL。流动相A为乙腈，流动相B为水。流动相比例为：初始，A为10%，B为90%；3 min时，A为60%，B为40%；5.5～7 min时，A为100%，B为0。

2 结果与讨论

2.1 硅胶柱分离虎眼万年青皂苷

称取虎眼万年青总皂苷5 g，硅胶柱层析方法分离。由图1可知，分离产物按照极性由小到大顺序流出，瓶号25～28，48～56，72～77，86～89，97～122为单点，单独收集，分别标记为A、B、C、D、E加以区分。

图1 虎眼万年青总皂苷硅胶柱分离成分TLC检测结果Fig.1 TLC for Ornithogalum caudaside sample separated by silica gel column chromatograph

将所得各单体皂苷组分单独收集，浓缩后称重，并计算得率，对比如表1。

表1 各组分洗脱分离收集表Tab.1 Yield of product

2.2 虎眼万年青皂苷单体的检测

UPLC检测虎眼万年青总皂苷及分离所得单体。精密称取各样品1 mg，分别溶于1 mL乙腈，完全溶解过0.45 μm微孔滤膜，取滤液。其UPLC检测图谱如图2～7所示。

由虎眼万年青总皂苷的色谱图可以看出，虎眼万年青总皂苷中含有很多组分，共有12个峰，其中D、E组分的峰值较高，峰面积也相对较大，含量相对较高，比较各色谱图，可以看出，本次硅胶柱层析对D、E组分的纯化效果较好。各样品保留时间及峰面积所占比例情况见表2。

图2 虎眼万年青总皂苷色图谱Fig.2 Chromatogram of caudaside

图3 A组分色谱图Fig.3 Chromatogram of A sample

图4 B组分色谱图Fig.4 Chromatogram of B sample

图5 C组分色谱图Fig.5 Chromatogram of C sample

图6 D组分色谱图Fig.6 Chromatogram of D sample

图7 E组分色谱图Fig.7 Chromatogram of E sample

表2 各组分色谱分析对比Tab.2 Analysis for chromatogram of product

3 结 论

硅胶柱分离虎眼万年青皂苷样品5 g，TLC跟踪检测，按照极性由小到大依次得到5种虎眼万年青皂苷单体。得率分别为2.6%、2.6%、3.6%、5.4%、12.6%。超高压液相色谱检测各样品，虎眼万年青总皂苷中D、E组分的含量相对较高，本次硅胶柱层析对D、E组分的分离效果相对较好。采用硅胶柱层析的方法可以初步达到分离纯化虎眼万年青总皂苷的目的。本实验对今后研究虎眼万年青单体皂苷的分子结构及其药理活性打下一定的基础。

[1] MIMAKI Y, KURODA M, KAMEYAMA A, et al. Cholestane glycosides from Ornithogalum saundersiae and their potent cytotoxic activity on various malignant tumor cells[J]. Tennen Yuki Kagohutsu Toronkai Koen Yoshishu, 1996, 38:313-318.

[2] 石磊,李娟,刘志强,等. 虎眼万年青多糖增强非特异性免疫和体液免疫的作用[J]. 吉林大学学报:医学版, 2002, 28(3):232-234.

[3] 石磊,段秀梅,胡梦林,等. 虎眼万年青多糖对小鼠T细胞及其细胞因子IL-2mRNA表达的影响[J]. 吉林大学学报:医学版, 2004, 30(5):678-680.

[4] 石磊,谭岩. 虎眼万年青多糖对小鼠免疫功能的调节作用[J]. 中国免疫学杂志, 2002, 18(11):799-803.

[5] TANG Yuping, YU Biao. The chemical constituents from bulbs of Ornithogalum caudatum[J]. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 2001, 10(4): 26-28.

[6] 肖冲,鱼红闪. 虎眼万年青皂苷的分离提取[J]. 大连轻工业学院学报, 2006, 25(2):93-95.

(XIAO Chong, YU Hong-shan. Separation and extraction of caudaside[J]. Journal of Dalian Institute of Light Industry, 2006, 25(2): 93-95.)