石油微生物16S rRNA基因PCR扩增研究

卞立红，曲丽娜，汪 洋,张 虹，黄永红

(1.大庆师范学院 生命科学学院，黑龙江 大庆 163712；2. 大庆师范学院 科研处，黑龙江 大庆 163712)

0 引言

16S rRNA为原核生物核糖体中一种核糖体RNA，大小约1.5Kb左右。其种类少，含量大(约占细菌RNA含量的80%)，分子大小适中，存在于所有的生物中，特别是其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称[1-4]。

近年来，16SrRNA基因技术在石油微生物生态的研究中起到越来越重要的作用，该技术的应用克服了传统的微生物培养和纯种分离技术的限制。填补了细胞生物学研究油藏微生物的生态的不足[5]。随着分子生物学和系统发育分析方法的发展，人们运用基于16S rRNA(rDNA)基因的分子生物学方法来分析复杂的生态系统，所有研究结果表明原油储层存在很高的微生物多样性，这些结果使人们进一步了解了原油储层微生物生态系统[6]。用基于16S rRNA(rDNA)基因的分子生物学方法来分析复杂的生态系统，通过荧光原位杂交(FISH)、克隆建库、对原油储坑地层水中微生物群落进行研究，并通过竞争PCR对其中优势菌群进行定量分析[7]。进一步了解原油储层微生物生态系统。目前16S rDNA的PCR扩增片段通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)的方法常被用来分析微生物群落结构的变化，通过对DGGE优势条带序列的研究来分析各群落中的优势成员[8]。对油田微生物提高原油采收率的现场应用提供很多有价值的信息。石油微生物16S rRNA基因保守区的扩增是先进分子水平鉴定微生物种类的一种有效实验方法。16S rRNA既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术来较容易地得到其序列，故被细菌学家及分类学家所接受[1]。所以，细菌系统分类学研究特设委员会建议依据系统发育关系分类。细菌的16S rRNA可变区序列因不同细菌而异，恒定区序列基本保守，所以可以利用恒定区序列设计引物将16S rRNA片断扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。并可通过对其序列的分析，判定不同菌属、菌种间遗传关系的远近[9]。对不同细菌的16S rRNA序列进行同源性比较分析是推断细菌的系统发育及进化关系的一个重要方法。通过上述的方法，我们进行对石油微生物16S rRNA基因的PCR扩增研究。

本实验以大庆油田分离纯化的某一种或几种石油微生物为实验材料，摸索合适的石油微生物基因组DNA的提取方法及合适的PCR扩增条件和反应体系，为后续本实验室开展石油微生物方面的分子水平实践指导有着重要的意义。

1 试验材料和试验方法

1.1 试验材料

将采集的大庆采油三厂排出井水样迅速进行真空抽滤，抽滤过程中于无菌布氏漏斗上分10次随机抽取1毫升水样接种到无机盐培养基中，并于37℃恒温箱中静止进行富集培养，OD600达0.4～0.6时，进行DNA提取。

1.2 试剂与仪器

1.2.1试剂

1)主要试剂有20mg/ml蛋白酶K、110mg/ml溶菌酶、1mol/l Tris、50mmol/l EDTA、5.0mol/l NaCl、酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)、异丙醇、700μl SET溶液、琼脂糖25g、1500bp DNA Marker、25μl SDS。

2)提取缓冲液：CTAB/NaCl(10%CTAB，0.7mol/l NaCl)，在80ml H2O中溶解4.1g NaCl，缓慢加入CTAB(十六烷基三乙酸溴化铵)，同时加热并搅拌，定容终体积至100ml。

3)引物序列如下：上游引物序列为：5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物序列为：5‘-CGGTGTGTACAAGACCC-3’。

4)TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒。

1.2.2仪器

高速离心机：TDL-40B(上海安亭仪器厂)；凝胶成像系统：UVP凝胶成像系统(Upland. U.S.A)；超低温冰箱：NR-C26WF11(松下)；自动灭菌装置：YXQ-LS-SⅡ(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；电热恒温水槽：HHS(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；制冰机：AF100-AS；电子天平：BS124.3(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；保温箱(电热恒温培养箱)：HPP-9162(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；多通道PCR仪：PTC-240(上海安亭仪器厂)等。

1.3 试验方法

1.3.1 微生物基因组DNA的提取方法

第一种方法为溶酶法，提取方法如下：

1) 细胞收集：0D600=0.4收集菌液1.5ml，置于12000 rpm离心5min；形成菌体细胞沉淀物。

2) 裂解细胞：弃上清，向离心所得菌体沉淀加入裂解缓冲液(1mol/l Tris、50mmol/l EDTA、1.0mol/l NaCl)，并加入700μlSET溶液，25μlSDS溶液，15μl蛋白酶K，180μl溶解酶，轻微混匀，直到细胞处于悬浮状态，置于37℃保温1h。

3)基因组DNA抽提：加入100μl5.0mol/lNaCl充分混匀，再加入80μlCTAB/NaCl溶液混匀，于65 ℃温育10min。

4)再加等体积的氯仿、异戊醇(24∶1)，置于12000 rpm离心5min。

5)吸上清，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，离心。

6)取上清液加0.6体积的异丙醇，醇沉30min，离心，自然风干后溶于50μl的TE，-20℃保存备用。

第二种提取方法为试剂盒法，步骤如下：

使用前请先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。

1) 取细菌培养液1-5ml，10，000rpm(-11，500×g)离心1分钟，尽量吸净上清。

2) 向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，震荡至菌体彻底悬浮。

3) 向管中加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。

4) 加入220μl缓冲液GB，振荡15秒，70℃放置10分钟，溶液应变清凉，简短离心以除管盖内壁的水珠。

5) 加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

6) 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱防如收集管中)，12，000rpm(～13，400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7) 向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm(～13，400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8) 向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm(～13，400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

9) 向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12，000rpm(～13，400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

10) 将吸附柱CB3放入收集管中，12，000rpm(～13，400×g)离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中的残余漂洗液。

11) 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2～5分钟，12，000rpm(～13，400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

1.3.2 PCR反应体系

1)R扩增的反应体系。25μl反应总体积，包括2μlPCR反应缓冲液，0.5μl10mmol/l dNTP混合液，10pmole引物各1μl，50ng基因组DNA，2.5U TaqDNA聚合酶，其余用去离子水补足。

2)CR条件的探索。首先设定PCR的温度，在50℃～60℃选择8个梯度，这8个梯度分别是50.6、51.8、53.0、54.2、55.4、56.6、57.8、59。经过琼脂糖凝胶电泳的检测，可判断最适条件为53.0℃。

3)PCR扩增的条件。95℃预变性10min，95℃变性50s，53℃退火50s，72℃延伸1min，循环30次。

4)琼脂糖凝胶电泳的检测。制备1%琼脂糖胶：称取0.3克琼脂糖，加入30毫升1×TAE，微波加热溶解，待冷却后，倒入制胶槽制成1%琼脂糖胶。吸5μlPCR产物，1μl10×Loading buffer进行混合，点样。在120V的电压下，电泳20min，紫外灯下扫描。将琼脂糖凝胶放在YLNO2000凝胶影像分析系统进行扫描，并拍照。

2 结果与讨论

2.1 结果

2.1.1 基因组DNA的检测结果

经过琼脂糖凝胶电泳的检测，图片上采用试剂盒法所显示的DNA条带成弥散状，而图片上采用溶菌酶法所显示的DNA条带亮度大，浓度、质量高，因此，采用溶菌酶法进行DNA提取要好于试剂盒法。

图1 基因组DNA琼脂糖检测结果

2.1.2 PCR扩增结果

16S rRNA基因PCR扩增出两条带的片段的分别是800bp和1400bp左右。

图2 石油微生物16S rRNA基因PCR扩增结果

2.2 讨论

微生物具有变异快的特点，微生物的变异除了受到微生物本身的生理特性影响外，外界的环境因子对其变异的影响也是不容忽视的。传统的微生物研究方法只能从微生物的形态学角度加以研究，而对于微生物受环境因子影响所造成的在分子水平上变异信息的捕捉能力是十分有限的。这就制约了微生物生态学研究的发展。分子生物学技术的发展，就能将微生物在基因层面上所发生的变异与环境因子相结合，对维持微生物生态系统平衡的动力学参数进行深入研究。

从油藏水样中抽提的DNA的质量是16SrRNA基因技术在油藏微生物生态研究中的应用成功的一个关键步骤，提取效率的低下或样品中其他物质的干扰，都会使实验结果发生偏差[10]。由于16SrRNA 序列的保守性和存在的普遍性以及核酸序列本身的稳定性，序列分析的重现性极高，基于当今分析技术的改进，应用16SrRNA 作为分子指标，可以实现快速、微量、准确简便的对微生物进行分类鉴定。

本文通过对石油微生物DNA的提取采用两种不同的方法，利用16SrRNA基因PCR扩增研究了石油微生物的大致类别。石油微生物DNA的提取采用了两种不同的实验方法：溶菌酶法和试剂盒法。通过实验比较发现，溶菌酶法提取石油微生物的DNA条带亮度大、浓度、质量高，而试剂盒法提取的DNA条带成弥散状，可能由于试剂盒法所要通过的滤膜次数多，故而DNA损失的量也多，造成了DNA条带呈弥散状。溶菌酶法较适合革兰氏阳性菌，而不适合提取革兰阴性菌的基因组DNA。本实验扩增的16S rRNA 基因两条片段大小分别是800bp和1400bp左右，符合该引物扩增的古菌和细菌的片段大小，是这两类菌的混合物。而古菌与细菌在进化树上相聚较远，亲缘关系较远，主要表现在结构的复杂程度以及各自某些独特的结构。相对细菌而言，古菌结构比较简单。古菌细胞壁有一种特殊成分叫塔罗糖醛酸。古菌没有肽聚糖，古菌的细胞膜存在独特的单分子层或单、双分子混合膜，其中含有醚键。而细菌细胞壁主要组份是肽聚糖，是一层较厚(5～80nm)、质量均匀的网状结构，细菌的特殊结构包括荚膜、鞭毛、菌毛和芽胞[11-13]。

3 结语

本实验中，溶菌酶法提取石油微生物优于试剂盒法，所提取的DNA浓度、质量高。16S rRNA基因PCR扩增以53℃，退火50 S为最适条件。初步断定，该地层石油微生物为古菌和细菌的混合菌。

[参考文献]

[1] 焦振泉，刘秀梅，孟昭赫. 16S rRNA序列同源性分析与细菌系统分类鉴定[J]. 国外医学卫生学分册，1998，25(1)：12-16.

[2] Janssen P H. Identifying the dominant soil bacterial taxi in libraise of 16 S rRNA and 16 S rRNA genes [J]. Applied and Environmental microbiology 2006, 72 (3): 1719-1728.

[3] 陈国忠，李文均，徐丽华，等 16S rRNA二级结构的研究进展及其在系统分类中的应用[J]. 生物学杂志，2005，25(5)：55-57.

[4] Nobler H F, Hoang L. The 30S ribosomal P site: A function of 16 S rRNA [ J ]. Fredrick K FEBS Lest, 2005， 579 (4): 855-858.

[5] 李志岗，杨官品. 水环境细菌16S rRNA 限制性片段长度多态性及群落结构分析[J]. 水生生物学报，2001，25(2)： 111-114.

[6] Shuck la J. 16SrRNA PCR for differentiation of pathogenic and non-pathogenic leptospira isolate [J]. Indian J Med Micro boil, 2003, 21: 25-30.

[7] 吕志堂，刘志横. 糖单孢菌16S rDNA 的PCR-RFLP分析[J]. 微生物学报，2000，40(6)：567-572.

[8] 苏尔古切夫. 二、三次提高原油采收率方法[M]. 卢文瑞，等译. 北京：石油工业出版社，1993：23-85.

[9] 刘文强，贾玉萍，赵宏坤,等. 利用半套式PCR 扩增16S rRNA 基因快速检测牛和猪附红细胞体[J]. 中国兽医学报，2006，26(3)：262-264.

[10] 贾俊涛，宋林生，李筠. T-RFLP 技术及其在微生物群落结构研究中的应用[J]. 海洋科学，2004，28 (3)：64-68.

[11] 包木太，汪卫东，王修林,等. 激活内源微生物提高原油采收率技术[J]. 油田化学，2002，19 (4):382-386.

[12] Erwin G Coeternal, Lauren S Collier, Kenco Koike, et al. Molecular ecological analysis of the gastro intestinal micro biota: Are view [J]. J. Nuts., 2004, 134:465-472.

[13] 柳承璋，宋林生，吴青. 分子生物学技术在海洋微生物多样性研究中的应用[J]. 海洋科学，2002，26(8) :27-30.