东北酸菜发酵中几株乳酸菌的筛选

李嘉祺,赵文婧,张 茜,段学强,单树花

(太原师范学院生物系,山西太原 030031)

东北酸菜发酵中几株乳酸菌的筛选

李嘉祺,赵文婧＊,张 茜,段学强,单树花

(太原师范学院生物系,山西太原 030031)

从东北酸菜汁液出发,有目的地筛选到3株菌株,通过对其形态特征、菌落特征及生化特征进行分析可知,3株菌株均为乳杆菌属。对筛选到的乳杆菌属进行酸菜发酵性能研究发现,其中菌株L2在发酵24 h后,产酸量达到2.5%,酸度达到1.73 g乳酸/100 mL,且发酵无异味,口味自然,效果较好。

乳酸菌;酸菜;选育

我国利用乳酸菌进行发酵,加工、贮存蔬菜的方式已有几千年的历史了[1],并在全世界许多国家和地区广为流传。其方法简便、易掌握,且能进一步改善蔬菜风味、增进食欲[2]。我国蔬菜资源丰富,酸菜作为我国东北地区一种传统的乳酸发酵蔬菜制品,口感清爽,营养丰富,风味独特[3],其汁液中富含乳酸菌活菌,赋予酸菜多种营养保健功效[4]。酸泡菜是世界性大众化蔬菜发酵制品,其主要发酵菌群是乳酸菌。目前对西式泡菜、朝鲜泡菜、四川泡菜发酵过程中微生物区系已有较多研究,但对于酸菜这一中国东北地区特有发酵制品的微生物学研究及接种后发酵过程中乳酸菌种类的变化,国内的报道还很有限。本研究旨在对传统自然发酵的酸菜进行乳酸菌的分离鉴定,为酸菜的纯菌发酵和现代工业化生产奠定基础[5-8],进而探索出接种微生物纯培养物促进蔬菜发酵的新方法用于工业生产[9]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 酸菜(东北特产)。

1.1.2 试剂 酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂、溴甲基酚紫、磷酸氢二钾、醋酸钠、柠檬酸铵、硫酸镁、Tween-80、盐酸、氢氧化钠、碳酸钙、过氧化氢,均为分析纯。

1.1.3 仪器 生化培养箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅。

1.1.4 培养基 ①初筛平板培养基:牛肉膏1%,酵母膏0.5%,蛋白胨1%,葡萄糖5%,琼脂1.5%,溴甲基酚紫0.04%,磷酸氢二钾0.2%,醋酸钠0.5%,柠檬酸铵0.2%,硫酸镁0.02%,Tween-800.1%,pH 6.6,121℃灭菌20 min;②复筛试管培养基:同初筛平板培养基,121℃灭菌20 min;③产乳酸鉴定[5]:通过纸层析乳酸定性试验确定出产乳酸细菌。纸层析法:滤纸,溶液系统为正丁醇∶甲酸∶水=10∶2∶15,显色剂为0.04%溴酚乙醇溶液,0.1 mol/L NaOH调pH至6.7,乳酸标准溶液浓度为2%,标准液、各菌株发酵液以毛细管点样,上行层析,显色比较各斑点的Rf值;④生理生化特性鉴定[8]:a.生化特性研究(接触酶反应):将待鉴定菌种接种于乳酸菌培养基斜面上,37℃培养20 h后,在斜面上取1环接种菌苔于载玻片,然后滴加1滴过氧化氢溶液,观察有无气泡产生;b.生理特性研究(生长曲线的绘制):将分离出的菌株接到液体种子培养基中,每隔4 h吸取菌液,以培养时间为横坐标,菌落总数的对数为纵坐标,绘制生长曲线。斜面培养基:葡萄糖2%的MRS固体培养基,121℃灭菌20 min;④液体种子培养基:葡萄糖5%MRS液体培养基,121℃灭菌20 min;⑤平板计数培养基:葡萄糖5%MRS固体培养基,121℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分离筛选[10]①初筛:取外观无污染,味道纯正的自然发酵酸菜液为分离样,采用10倍梯度稀释法,选择适宜的稀释度,涂布在乳酸菌初筛平板上,37℃下培养48 h,挑取溶CaCO3圈较大、培养基变黄的菌落;②复筛:将初筛得到的菌株用接种针转接到复筛试管斜面培养基上,37℃下培养36 h,再挑选试管内斜面培养基颜色变化较大的菌株,接到平板培养基上纯化、分离出单菌落。

1.2.2 乳酸菌鉴定方法 ①形态特征鉴定[11]: a.菌落形态:观察平板培养基上菌落形态,分离单菌落并记录结果;b.菌株革兰染色:将所分离的单菌落进行革兰染色,于100倍油镜下观察;c.菌落数的检测:采用菌落平板计数法测定;②产酸量测定:采用0.1 mol/L的NaOH碱液滴定法,以酚酞为指示剂,分析结果以乳酸计。

2 结 果

2.1 菌种的初筛结果

以在初筛平板培养基上单菌落黄色菌圈大小进行筛分,挑得120株菌。

2.2 菌种的复筛结果

取0.9 cm×9 cm试管,向其中注入3.0 mL的复筛试管培养基,摆斜面后转接菌种,挑选试管内培养基颜色变化较大的菌株,转接到平板培养基上纯化、分离单菌落,划平板纯化、分离,得到3株,编号分别为L1、L2、L3。

2.3 菌种的鉴定结果

根据菌种形态培养特征和革兰染色、乳酸层析、接触酶反应,目的菌株L1、L2、L3均为乳杆菌,鉴定结果如下。

2.3.1 形态鉴定结果 菌种的形态特征是鉴别菌种的重要特征参考,乳酸菌多为杆菌和球菌,革兰染色多为阳性,但有些菌株培养时间过长会变为阴性。所筛选的产酸较高的3株菌37℃下,在分离培养基上培养48 h的菌落和镜检形态特征见表1、表2。

表1 菌株在分离培养基上的菌落形态Table 1 Morphological characteristics of strains

表2 菌株镜检形态特征及生化特性比较Table 2 Comparasion of morphological characteristics and biochemical characteristics

2.3.2 乳酸菌的鉴定结果 ①产酸量的测定:由表3结果可知,各菌株的溶CaCO3圈的大小与产酸量的多少呈正相关;在筛选的3株菌株中以L2的溶CaCO3圈最大,产酸量也最多,达2.5%,其次为L3,产酸量为2.3%,再次为L1,产酸量为2.1%。其他菌株溶CaCO3圈均不如此3株菌株,因此,L1、L2、L3作为优选出的3个高产酸菌株;②纸层析乳酸定性结果:采用乳酸定性分析,通过纸层析法对乳酸标准溶液和L1、L2、L33株菌株的发酵液进行对比试验,结果表明,L2、L3和L1的发酵液中均含有乳酸,说明此3株菌株为产乳酸菌株。

表3 标准乳酸与几株菌株发酵液纸层析的Rf值比较及产酸量Table 3 Comparasion of Rf value and acid production

2.3.3 生理生化特性鉴定结果 ①生化特性鉴定结果:接触酶反应:过氧化氢酶能催化过氧化氢分解成氧和水,大多数乳酸菌触酶反应阴性,故此项测定是乳酸细菌鉴定的一个重要的依据,反应结果见表2、表4;②生理鉴定结果:L2、L3、L1菌株生长曲线见图1,发酵过程酸度变化曲线见图2。

图1 L2、L3、L1菌株生长曲线Fig.1 Growth curves ofL2、L3、L1 strains

表4 L1、L2、L3的生化鉴定结果Table 4 Physiological and biochemical experiment ofL1、L2、L3

由图1可见,L1菌株在培养4 h后即进入对数生长期,20 h进入稳定期,L2和L3菌株具有类似的生长曲线,32～48 h进入稳定期。从3菌株的比较看,生长的前期以L1为主,后期以L2和L3为主。

图2 发酵过程酸度变化曲线Fig.2 Fermentative process acidity change curve

3 讨 论

本实验从酸菜汁中分离出3株典型的产乳酸的菌株,经纸层析法测定所产酸为乳酸,经形态特征、菌落特征和生理生化特征鉴定均为乳杆菌属; 3株菌在酸菜发酵过程中都表现出快速产酸、高发酵性能和良好的酸菜发酵环境适应能力。其中菌株L2在发酵24 h后,产酸量达到2.5%,酸度达到1.53 g乳酸/100 mL,可知L2为酸菜发酵高产酸菌株,在大规模工业生产时可以对L2菌株扩大培养,从而大大提高工业生产的效率。

[1]钟之绚,郭剑.酸白菜发酵中乳酸菌群的分析[J].微生物学报,1995,31(1):74-76.

[2]任涛,于英.微生物对蔬菜研制品风味及品质的影响[J].中国调味品,1989,(7):5-8.

[3]侯红漫,宋海波,刘扬,等.酸菜汁中乳酸菌的分布[J].食品科学,1997,18(1):29-32.

[4]杨沽彬,郭兴华,张篪,等.乳酸菌:生物学基础及应用[M].北京:中国轻工业出版社,1996.

[5]陈晓平,刘华英.自然发酵酸菜汁中乳酸菌的分离筛选与鉴定研究[J].食品科学,2006,27(2):91-94.

[6]闵华,袁林峰.发酵蔬菜乳酸菌的分离及培养基的筛选[J].江西农业学报,2002,14(2):62-64.

[7]沈国华,卢英.优良乳酸发酵菌种特性的研究及菌种筛选[J].中国调味品,2002,(3):22-25,35.

[8]凌代之,东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京:中国轻工业出版社.1999.

[9]罗斯A H(朱庆裴等译).发酵食品[M].北京:轻工业出版社,1989:10.

[10]熊涛,徐立荣,范镭,等.蔬菜发酵专用乳酸菌的选育[J].食品科学,2008,29(6):264-267.

[11]布坎南R.E,吉本斯R.E.,等.伯杰细菌鉴定手册(第8版) [M].北京:科学出版社,1984.

Screening of Some Lacto-Bacteria Strains from Sauerkraut Fermentation in NE China

LI Jia-qi,ZHAO Wen-jing,ZHANG Xi,DUAN Xue-qiang,SHAN Shu-hua
(Taiyuan Normal Uni.,Shanxi030031)

Three strains were screened intentionally starting from sauerkraut juice collected from NE China.It was known through analyses of their morphological,colony,and biochemistry features they all belonged to the genus of Lactobacillus.It was found after studying on 24 h after cabbage sauerkraut fer mentation that strain L2 produced acid as high as 2.5%,with the acidity at 1.73 g lactic acid/100 mL,and the fer mentation did not produced strange odor, the sauerkraut tasted natural and produced fine result.

lacto-bacteria;sauerkraut;breeding

Q93-331

A

1005-7021(2010)06-0068-03

太原师范学院2009年大学生科技创新项目

李嘉祺 女,生物技术专业。研究方向为微生物学。E-mail:lijiaqi1861@163.com

＊通讯作者。E-mail:maomaozx@126.com

2010-09-07;

2010-11-05