成肌细胞移植改善心肌梗死大鼠心功能的机制

马牧欣 哈尔滨医科大学附属第一医院心内四科 150001

成肌细胞移植改善心肌梗死大鼠心功能的机制

马牧欣 哈尔滨医科大学附属第一医院心内四科 150001

目的：研究心肌梗死大鼠骨骼肌成肌细胞移植后心功能变化情况，同时观察移植后的成肌细胞的存活及P2X1受体的表达情况。探讨骨骼肌成肌细胞移植对大鼠心肌梗死后心功能的改善作用的机制。方法：以同种系Wister大鼠为研究对象，取其股四头肌肌组织，采用胶原酶、链酶蛋白酶两步消化法获取大鼠骨骼肌成肌细胞进行体外培养。取同种系Wister大鼠30只随机分为2组（对照组和移植组）采用结扎冠状动脉的方法制造心梗模型，模型建立一周后再次开胸分别以分点注射法于心脏梗死区输入细胞培养液（对照组）或成肌细胞悬液（移植组）。于建模前、成肌细胞移植术前及移植术后第一、二周行超声心动检测。处死动物后，进行普通HE染色，抗myosin、抗P2X1受体免疫组化染色。结果：超声显示骨骼肌成肌细胞移植后二周，大鼠心脏功能较移植前有明显改善，其中射血分数由（40.3±2.5）%增加到（52.1± 2.3）%且与对照组相比有显著差异（P﹤0.05）。普通HE染色发现，移植组的心梗区域可见红色的条索状团块。抗myosin染色证实有移植的细胞存在。抗P2X1受体染色阳性。结论：骨骼肌成肌细胞移植后能在大鼠体内存活，移植二周后对心肌梗死后心功能降低即有明显的改善作用，这可能与P2X1受体对细胞间连接的调节及其介导的正性肌力作用有关。

骨骼肌成肌细胞；心肌梗死；细胞移植；P2X1受体；缝隙连接

骨骼肌成肌细胞（skeletal myoblast）是一种位于肌纤维的肌膜与基底膜之间的组织干细胞，在适当条件下可分化成有收缩能力的肌细胞。自上个世纪九十年代起，科学家们就开始了成肌细胞移植治疗心肌梗死的研究，证实处于心脏微环境中的成肌细胞趋向于向心肌细胞分化，减缓心梗后心脏射血分数的降低，增强疤痕区的收缩功能。Dowell[1]等进一步的研究也证明尽管缺乏成肌细胞和心肌细胞间形成有效连接的证据，但移植对左心收缩功能的改善是明显而持续的，且与移植细胞的数量呈正相关。那么，移植的骨骼肌成肌细胞到底是通过什么机制改善心功能的，它和心肌细胞间究竟能否形成有效的电生理连接，二者之间的矛盾使电机械偶联的研究又成为近来的热点，其中以心室肌细胞缝隙连接的主要连接蛋白43（connexin 43）的研究居多。

心肌细胞之间的缝隙连接传导可通过ATP与connexin之间的特异性配体-受体相互作用进行调节。近来有报道P2X1受体（ATP受体的亚型之一）与Cx43密切相关[2]。本试验主要研究成肌细胞移植入大鼠心肌梗死区后心功能的改善情况及是否有P2X1受体的表达，初步探讨P2X1受体在成肌细胞移植改善心梗后左心功能中的可能机制。

一、材料与方法

1 大鼠骨骼肌成肌细胞的提取、纯化、培养及鉴定

选用成年Wistar大鼠，体重150～180g雌雄不限，无菌条件下切取股四头肌1g，PBS冲洗后剔除脂肪组织，剪成1～2mm3的小块后PBS漂洗2次，37℃水浴摇床中酶解30～50min(胶原酶IA，1.0mg／ml)，加PBS终止消化，漂洗2次，1000r/min离心5min，弃上清，继之加入1%链酶蛋白酶于37℃水浴箱中消化20～30min，加培养液终止消化，400目不锈钢筛网过滤，1000r/min，5min离心，弃上清后加2ml细胞增殖培养液（含20% FBS的Ham’s F10）制成细胞悬液，缓缓加入含20%/60%percoll的10ml离心管中，800r/min离心15分钟。吸取中层液面入10ml离心管中，PBS漂洗3次，沉淀用4ml增殖培养液重悬，吸入T25塑料培养瓶，放入细胞培养箱中培养(37℃，5%CO2)。接种密度为1～3×105/ml。

2 大鼠心梗模型的建立

取成年wistar大鼠，体重200～230g，雌雄不限，随机分为2组（实验组及对照组），每组15只。10%水合氯醛麻醉（3ml/ kg，ip）后，16G静脉留置针直视下气管插管，确认进入气管后，右侧卧位，接呼吸机（参数：volum模式，呼吸频率50/ min，潮气量10cc/kg）。于心脏搏动最强处，多为第4肋间开胸，暴露心脏后用开胸器撑开肋骨良好显露术野。用5/0带线缝合针在左心耳与肺动脉圆锥之间平左心耳下缘迅速缝扎左前降支近端，结扎即刻见左室前降支供血区域变白即为结扎确切。膨肺后关胸，缝合皮肤。缝合前伤口局部撒硫酸庆大霉素预防感染。手术后大鼠约30min完全清醒。

3 骨骼肌成肌细胞及培养液的回输

第二代成肌细胞生长至80%～90%密度时，用0.25%胰酶＋0.02%EDTA消化，细胞计数板计数细胞个数，并进行台盼蓝染色计算活细胞占95%以上。Ham’s F10漂洗3次以洗去残余血清。用Ham’s F10制成浓度为2～3×107/ ml的细胞悬液，放入冰盒内以备移植用。心梗1周后的大鼠，10%水合氯醛麻醉（3ml/kg，ip）后，16G静脉留置针直视下气管插管，确认进入气管后，仰卧位，接呼吸机（参数：volum模式，呼吸频率50/min，潮气量10cc/ kg）。取左侧胸骨旁纵切口，剪断第2～4肋骨后，剪开胸膜，暴露心脏后用开胸器撑开切口良好显露术野。眼科镊小心剥离心脏与周围胸壁粘联组织，暴露心肌梗死区，可见梗死区心肌变白，表面有纤维素附着。吸管吹匀离心管中的细胞悬液，用1mlBD针吸取100微升细胞悬液，分5点斜刺入梗死区，每点注入25微升细胞悬液，观察5min后，膨肺关胸，缝合皮肤。缝合前伤口局部撒硫酸庆大霉素预防感染。手术后大鼠约40min后完全清醒。

4 记录数据

4.1 超声心动检测

以超声心动仪（HP）检测大鼠心功能。所有指标均取五个连续心动周期的平均值。试验鼠的心率、心室射血分数、左室短轴缩短率的测定以鉴定心脏功能状况，并将各组测量值进行比较。用SPSS10.0统计学软件进行统计学分析，所有数据均以均数±标准差即 ±s表示，组间比较应用t检验，以P﹤0.05作为差异有显著意义。

4.2 病理检测

取原代细胞及3代细胞消化后进行细胞爬片，待长至80%～90%密度时用4%多聚甲醛固定，以备免疫组化检测成肌细胞特异性抗体myosin及desmin之用。

大鼠心梗两周，采集数据后，将试验大鼠处死，心肌组织送检病理，进行常规HE染色，抗myosin、抗P2X1受体免疫组化染色。

二、结果

1 大鼠骨骼肌成肌细胞的培养

分离的原代骨骼肌成肌细胞成球形，折光性强。培养2小时后细胞开始贴壁，24小时后贴壁完全，细胞逐渐延展成梭形或纺锤形（图1），随培养时间的延长，细胞增殖、迁移并逐渐规律性地沿一个方向平行排列。当细胞融合到80%以上后，不需分化培养基即可自发性地相互融合，形成肌管（图2）。为避免成肌细胞融合形成肌管，待细胞长成80 %密度时即进行传代。传代细胞30min即开始贴壁，12小时贴壁完全，增值速度较原代细胞明显加快，平均7天传代一次。免疫组织化学染色显示desmin及myosin在成肌细胞及肌管中均为阳性（图3、4，未着色的为混杂的成纤维细胞）。

2 大鼠心梗模型的建立及细胞回输

共2只大鼠死亡，均为实验组大鼠，死亡率6.6%。死亡原因，一只为术中出现室颤，另一只为二次开胸时组织粘连，胸腔出血。结扎前降支后，肉眼可见结扎远端心肌颜色变浅，主要局限在左心室，靠近心尖部较为明显（图5）。正常和缺血交界处充血，颜色发绀。心梗1周后二次开胸，可见梗死区心肌变白，表面有纤维素附着（图6）。进一步证实大鼠心肌梗死模型建立成功。

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3 心功能测定

超声心动检测心率、射血分数短轴缩短率等各指标显示，心梗建立前各组各检测指标间无明显差异；心梗建立后1周，细胞及培养液移植前各检测指标较组内心梗前有明显差异，组间差异无统计学意义；反映心脏收缩功能的EF%和FS%于移植后2周明显增高，且移植细胞组明显高于移植后1周检测值和对照组检测值；对照组在移植后不同时间点测量值无显著性差异（表1）。

4 HE染色及免疫组化

正常心肌组织心肌纤维排列均匀整齐，横纹清楚，细胞大小均匀一致，细胞质丰富均匀（图7）。心梗模型建立后1周，心肌组织切片HE染色可见肌细胞明显肿胀，灶性坏死区核溶解，炎细胞浸润（图8）。移植组术后2周心肌内可见细胞核相对较大，红色条索状的成团细胞，周围有炎细胞浸润（图10）；而对照组未见成肌细胞（图9）。免疫组化显示，在移植部位有成肌细胞特异性抗体myosin染色阳性的细胞（图11，深棕色，胞浆）；胞膜可见P2X1受体染色阳性（图12，深棕色，胞膜）。

三、讨论

骨骼肌成肌细胞是源于胚胎中胚层的干细胞，在正常骨骼肌中，它位于基底膜与肌纤维浆膜之间，处于静止状态。当受到外界刺激,在应激状态下可以分裂、增生，形成新的肌纤维，是骨骼肌再生的储备力量。作为成体干细胞的一种，它具有横向分化的潜能，多项动物及临床试验表明[3-5]，骨骼肌成肌细胞移植入心肌梗死区可以存活并改善心梗后心功能。

本实验应用胶原酶及链酶蛋白酶两部消化法成功培养出成肌细胞，percoll的应用能够有效的去除部分成纤维细胞及肌碎片，加快原代细胞贴壁时间。细胞生长曲线显示第6天即可达到对数生长期，增值明显加快。细胞爬片进行desmin及myosin（肌生成素）染色均为阳性。

细胞的移植时间选择在心肌梗死模型建立后的第7天，主要依据是[6]，心肌梗死后的5天内是炎症反应期，且最初24小时最为强烈，在此期间植入将导致细胞参与到炎症的级联反应中，将影响有效的肌细胞和血管的生成。而心肌梗死后7天时，血管内皮生长因子的浓度能达最高峰，心肌梗死2周，瘢痕组织已经开始形成。因此，细胞移植的理想时间点是心肌梗死发生后的7天至14天之间。

对心肌梗死大鼠实行骨骼肌成肌细胞移植后心功能的检测，通过与对照组（培养液移植组）相对比发现成肌细胞移植能对心肌梗死大鼠的心功能起到明显的改善作用。超声心动检测心率、射血分数、短轴缩短率等各指标显示，心肌梗死建立前，各组各检测指标间无明显差异；心肌梗死建立后1周，与梗死前比较，两组心功能均降低，但组间差异无统计学意义；反映心脏收缩功能的EF %和FS%，于移植后2周明显升高，且明显高于对照组和移植后1周检测值；对照组在移植后不同时间点测量值无显著性差异。说明骨骼肌成肌细胞移植有助于心肌梗死大鼠心脏收缩功能的改善。

虽然骨骼肌成肌细胞始终不能转化成心肌细胞[7]，但以往的动物实验[8-10]表明骨骼肌成肌细胞在移植入心梗部位后可以成为可成活的肌肉组织，并能改善受损心脏的收缩功能，并且某些表型将变得能与心肌细胞相似，认为虽然移植的成肌细胞不是形成了心肌细胞，但是可分化成能负担心脏工作的慢收缩细胞。本实验选择的myosin抗体是MY-32克隆，可与骨骼肌肌凝蛋白重链（myosin heavy chain）反应，但不与平滑肌或心肌的肌凝蛋白反应。第3代成肌细胞爬片的myosin染色阳性，移植后2周的心梗大鼠心肌梗死区域亦可见myosin阳性染色的细胞，形成条索状纤维，而在对照组未见类似细胞生长，myosin染色亦阴性。这表明移植2周后，成肌细胞可在心肌梗死区域存活。

1972年Burnstock首次提出“嘌呤受体”的概念，描述细胞膜腺苷受体和ATP受体。对胞外腺苷敏感的受体称Pl，属G蛋白偶联受体家族；胞外核苷酸的受体称为P2，包括P2X和P2Y两类，其中P2Y属G蛋白偶联受体家族，P2X则是配体ATP门控的离子通道，当胞外ATP结合时P2X通道打开，允许阳离子通过。在哺乳动物细胞内，有5个P2Y（P2Yl，P2Y2，P2Y4，P2Y6，P2Y11）和7个P2X（P2Xl～7）受体已被克隆并阐明其药理学特性。

在心肌中，临近的心肌细胞是通过闰盘相连接的，闰盘是细胞膜的一个特殊部位，包括缝隙连接、膜表面黏附分子及桥粒。而其中的缝隙连接是一种离子通道，细胞与细胞之间动作电位的快速传导和化学信号的直接传递就是通过缝隙连接实现的。哺乳动物心肌细胞的缝隙连接主要是connexin43，因此connexin43成为研究移植的骨骼肌成肌细胞与心肌细胞之间电-机械偶联的重要目标。近来的研究[11]发现在体外共同培养的心肌细胞与骨骼肌成肌细胞可形成同步搏动的网络，甚至在免疫荧光染色后在共聚焦显微镜下发现了二者之间可能存在由N-cadherin和Connexin43介导的连接。而动物实验[12]也发现来自于宿主心肌细胞的电活动可能也能引起骨骼肌细胞的收缩，但该研究者认为电活动是通过细胞膜直接接触传导的，而不是通过有效连接快速传导的。骨骼肌成肌细胞与心肌细胞间存在电-生理偶联始终没有直接证据。Lele Jiang 等[2]研究发现，在人的左心室中，P2X1受体的表达与connexin43密切相关，部分P2X1受体与connexin43一样都在闰盘中表达，主要集中于闰盘的中部。在闰盘表达的P2X1受体的功能目前还不十分清楚。早在1990年，Sugiura等[13]即发现，在心肌细胞中，ATP可通过与特异性的受体结合调节缝隙连接通道蛋白，进而调节缝隙连接的选择通透性。以往对其它细胞的研究亦表明[14-17]，ATP可通过调节connexin43的表达进而促进缝隙连接选择通透性的形成，而且它可能是一种促进细胞与临近细胞形成缝隙连接的信号分子。而ATP为P2X1受体的配体，ATP、P2X1受体以及connexin43之间是通过什么通路进行相互作用和调节的目前尚不十分清楚，还有待遇进一步的研究。

P2X1受体表达的另外一项作用可能为其介导的正性肌力作用。当任何一种亚型的P2X受体与胞外ATP结合时，P2X通道打开，允许阳离子通过，如钠、钾、钙离子等(但以钙离子的通透性为著)，从而引起膜电位改变，L型Ca2＋通道开放，Ca2＋内流促使肌浆网内的钙池释放更多的Ca离子，胞内钙增多，继而引起细胞收缩力增强[18-19]。免疫组化显示P2X1受体在血管平滑肌细胞和心肌细胞中表达，在大鼠心肌细胞中表达水平较低，但充血性心力衰竭大鼠左心室的P2X1受体mRNA水平增加了2.7倍[20]。可能与缺氧的心肌细胞能够释放ATP[21]，使P2X1受体表达上调，发挥P2受体介导的正性肌力作用[22]有关。心肌梗死区域中存活的成肌细胞所表达的P2X1受体可能会发挥其正性肌力作用，加强心肌梗死区的收缩力，从而改善整体的心功能。

总之，在成功移植了成肌细胞并改善心梗大鼠心功能的基础上，P2X1受体表达阳性，推测与P2X1受体在改善心功能方面的作用主要有以下两点：1）P2X1受体与缝隙连接蛋白connexin43之间关系密切，可调节connexin43的表达和电信号或化学信号的传递，进而完善成肌细胞之间及成肌细胞与心肌细胞之间的同步收缩；2）P2X1受体可通过特异性配体ATP的结合而发挥正性肌力作用，从而加强心肌梗死区的收缩力。

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10.3969/j.issn.1001-8972.2010.21.101

马牧欣,心内科硕士，医师。

AbstractObjective: Evaluate the effect of rat skeletal myoblast transplantation on heart function of myocardial infraction, the survival in infracted myocardium, and the expression of P2X1 receptors in grafted myoblast.Methods: Thirty male Wister rats were divided at random into transplantation group(n=15) and control group(n=15).Acute myocardial infraction was induced by ligation of left anterior descending coronary artery.Myoblast was draw from tibial muscle of rats, cultured.Myoblast was injected into the infracted region of transplantation group, culture medium was injected into the infracted region of control group at 1 week after infraction.Cardiac function was evaluated before MI, 1 week after MI, 1 and 2 weeks after cell delivery.2 weeks after MI, HE, antimyosin and anti-P2X1 receptors staining were performed.Result: Compared with control group, left ventricular ejection function (LVEF) and fractional shortening (FS) were improved significantly 2 weeks after transplantation.At the infracted region of transplantation group, myosin-positive cells were found, and were positively stained by P2X1 receptors staining.Conclusion: Transepicardial delivery of skeletal myoblast can significantly improve cardiac function and survive at the infracted region.The mechanism of the improvement of cardiac function maybe related with the presence of P2X1 receptors at the infracted region, which suggests their role in the restoration of gap junction between cardiomyocyte and the inotropic effect mediated by P2X1 receptors.

Key wordsskeletal myoblast；myocardial infraction；cell transplantation；P2X1 receptors gap junction