老龄大鼠脑缺血/再灌注微血管生成的变化意义

2010-09-20李建生周友龙高剑峰杨歆科赵跃武刘政国刘敬霞

中风与神经疾病杂志 2010年2期

李建生, 刘轲, 周友龙, 高剑峰, 杨歆科, 赵跃武, 刘政国, 刘敬霞

微血管损伤与生成是缺血性脑损伤的重要病理生理环节。随着增龄改变,老年较青年脑缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤病理生理有不同特点[1],我们以往研究表明[2,3],老龄大鼠脑缺血/再灌注神经细胞凋亡、脑组织超微结构损伤和微血管基底膜破坏较青年大鼠有明显特点。为进一步探讨老年脑缺血/再灌注损伤后微血管生成方面的特点,本研究以老龄大鼠为研究对象,通过线栓法制备大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)动物模型,从脑微血管损伤与生成变化等方面揭示老年脑缺血/再灌注微血管生成的规律及意义,为进一步探讨老年脑缺血/再灌注病理生理特点提供依据。

1 材料

1.1 动物雄性 Sprague-Dawley(SD)青年大鼠 5～6月龄 44只(300～350g,动物合格证号：医动字第 410117号);雄性 SD老龄大鼠 20～21月龄 44只(450～600g,动物合格证号：医动字第 410117号),由河南省实验动物中心提供。

1.2 主要试剂与仪器兔抗鼠 CD34单克隆抗体、SP试剂盒由福州迈新生物技术开发公司提供;原位末端标记细胞调亡试剂盒由武汉博士德生物试剂公司提供;OLYMPUS BX51显微镜、OLYMPUSDP70图像采集系统均由日本奥林巴斯株式会社生产;Image-Pro Plus 5.1图像分析系统由美国Media Cybernetics公司提供。

2 实验方法

2.1 动物分组与处理 SD雄性青年组大鼠,随机分为青年假手术组、青年模型组脑缺血 3h、缺血 /再灌注 (I/R)1d、3d、6d、12d;SD雄性老龄组大鼠,随机分为老龄假手术组、老龄模型组脑缺血 3h、I/R 1d、3d、6d、12d。青年大鼠按随机数字表分组,老龄大鼠按体重分层随机法分组,每组每个时间点6只。

2.2 模型制备参照 Longa等[4,5]报道的方法加以改进。

2.3 指标检测

2.3.1 微血管密度(microvessel density,MVD)及血管场面积检测采用免疫组织化学抗生物素蛋白-过氧化酶(S-P)染色法。石蜡切片经脱蜡、水化,3%H2O2抑制内源性过氧化物酶,5%正常山羊血清封闭后,滴加 CD34第一抗体,4℃过夜。滴加生物素标记的第二抗体,37℃温育 30min。滴过氧化酶-链霉卵白素,37℃温育 30min。DAB显色液显色。以上各步骤均经 PBS冲洗 3次。苏木素复染、封片。镜下观察到血管内皮细胞胞膜棕黄色颗粒者为 CD34染色阳性。凡呈现单个内皮细胞或内皮细胞簇者均为一个血管计数,管腔大于 8个红细胞直径,或带有较厚基层的血管均不计数。选取大脑皮质缺血周边区每个区域内 5个镜下高倍视野(×400)进行血管计数,表示 MVD,并采用全自动彩色图像处理系统进行图像分析,测定血管场面积比。本实验中所计算血管场面积为所测有效血管截面面积与统计场面积的千分比。

2.3.2 细胞凋亡检测常规石蜡切片,DAB显色,苏木素复染,蒸馏水洗,酒精脱水,二甲苯透明,封片。镜下观察细胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡细胞。每个标本在高倍镜下(×400)选取大脑皮质缺血周边区、中心区表达均匀的区域,随机观察 5个高倍视野下凋亡神经细胞的总数,计算其平均值。

2.3.3 电镜观察脑病理组织切块经固定脱水浸透包埋,制成超薄切片,切片经铅-铀染色,用HITACHI-7500透射电子显微镜观察,摄片。每个标本观察大脑皮质区神经元、神经胶质细胞、血管内皮细胞的病理变化。

2.4 统计学方法计量数据均以均数(χ)±标准差(s)表示,采用 SPSS 13.0 ForWindows软件进行统计处理。计量数据资料先进行正态分布检验,符合正态分布者,两组间比较采用独立 t检验,多组组间比较采用单因素方差分析;不符合正态分布者进行数据转化使其符合正态分布或采用非参数检验。显著性水准取 α=0.05。

3 结果

3.1 各组大鼠 MVD、血管场面积及细胞凋亡变化(见表1) 青年模型组 I/R 1d、3d、6d、12d大鼠 MVD高于青年假手术组(P＜0.01);青年模型组I/R 3d、6d、12d大鼠 MVD高于青年模型组脑缺血3h、I/R 1d(P＜0.01)。老龄模型组 I/R 6d、12d大鼠 MVD低于老龄假手术组、老龄模型组脑缺血 3h、I/R 1d(P＜0.05,P＜0.01)。与青年动物组同时间点比较,老龄假手术组大鼠 MVD增高(P＜0.01),老龄模型组 I/R 1d、3d、6d、12d大鼠 MVD均降低(P＜0.05,P＜0.01)。老龄模型组大鼠 MVD自缺血3h持续下降至 I/R 12d;青年模型组大鼠 MVD于脑缺血 3h开始增加,I/R 6d达峰值,持续至 I/R 12d。青年模型组 I/R 1d、3d、6d、12d大鼠血管场面积均高于青年假手术组(P＜0.01);青年模型组 I/R 1d、3d、12d大鼠血管场面积高于青年模型组脑缺血 3h(P＜0.01)。青年模型组 I/R 6d大鼠血管场面积低于青年模型组 I/R 1d(P＜0.01);青年模型组 I/R 12d大鼠血管场面积高于青年模型组 I/R 6d(P＜0.01)。老龄模型组 I/R 1d大鼠血管场面积高于老龄假手术组(P＜0.05);老龄模型组 I/R 12d大鼠血管场面积低于老龄模型组脑缺血 3h(P＜0.05);老龄模型组 I/R 3d、6d、12d大鼠血管场面积低于老龄模型组 I/R 1d(P＜0.01)。与青年动物组相同时间点比较,老龄模型组 I/R 1d、3d、6d、12d大鼠血管场面积均降低(P＜0.01)。青年模型组 I/R 1d大鼠血管场面积明显增加,I/R 1d～6d逐渐下降,至 I/R 12d又明显增高;老龄模型组大鼠血管场面积于 I/R 1d达峰值,后逐步下降。

青年模型组各时间点大鼠细胞凋亡数均多于青年假手术组(P＜0.01),青年模型组 I/R 6d、12d大鼠细胞凋亡数多于青年模型组脑缺血 3h(P＜0.05,P＜0.01);青年模型组 I/R 6d大鼠细胞凋亡数分别多于青年模型组 I/R 1d、3d(P＜0.05,P＜0.01)。老龄模型组 I/R 1d、3d、6d、12d大鼠细胞凋亡数分别多于老龄假手术组、老龄模型组缺血 3h(P＜0.05,P＜0.01),老龄模型组 I/R 3d、6d大鼠细胞凋亡数多于老龄模型组 I/R 1d(P＜0.05,P＜0.01);老龄模型组 I/R 6d、12d大鼠细胞凋亡数少于老龄模型组I/R 3d(P＜0.05,P＜0.01);老龄模型组I/R 12d大鼠细胞凋亡数少于 I/R 6d(P＜0.01)。与青年动物组相同时间点比较,老龄假手术组及老龄模型组 I/R 3d、6d大鼠细胞凋亡数增多(P＜0.01)。老龄模型组细胞凋亡峰值出现早于青年模型组,青年模型组细胞凋亡数于 I/R 6d达峰值,至 I/R 12d稍有减少;老龄模型组细胞凋亡数 I/R 3d达到峰值,I/R 3～12d逐渐减少。

表1 各组大鼠MVD、血管场面积及细胞凋亡数变化比较(±s,n=6)

注：n代表动物只数,每个时点 6只。与青年假手术组比较＆＆P＜0.01;与青年模型组脑缺血 3h比较○○P＜0.01,○P＜0.05;与青年模型组 I/R 1d比较△△P＜0.01,△P＜0.05;与青年模型组 I/R 3d比较◇◇P＜0.01;与青年模型组 I/R 6d比较☆☆P＜0.01;与老龄假手术组比较##P＜0.01,#P＜0.05;与老龄模型组脑缺血 3h比较●●P＜0.01,●P＜0.05;与老龄模型组 I/R 1d比较▲▲P＜0.01,▲P＜0.05;与老龄模型组 I/R 3d比较◆◆P＜0.01,◆P＜0.05;与老龄模型组 I/R 6d比较★★P＜0.01;与青年动物组相同时间点比较**P＜0.01,*P＜0.05

组别时点 MVD(个) 血管场面积(‰) 凋亡细胞数(个)青年假手术组青年模型组老龄假手术组老龄模型组I 3h I/R 1d I/R 3d I/R 6d I/R 12d I 3h I/R 1d I/R 3d I/R 6d I/R 12d 5.50±1.53 5.96±1.65 7.50±1.87＆＆9.75 ±2.31＆＆○○△△10.13 ±2.09＆＆○○△△10.00 ±1.96＆＆○○△△6.88±1.60**6.63±1.53 6.50±1.59*6.04±1.27**5.71±1.76#●▲**5.29±1.12##●●▲▲**23.37±7.90 27.16±5.55 36.27±12.24＆＆○○35.17±10.48＆＆○○31.34±8.33＆＆△△39.42±14.30＆＆○○☆☆23.97±5.46 25.10±6.58 28.24±5.68#**24.97±7.11▲▲**21.83±6.68▲▲**20.64±6.56●▲▲**12.63±1.51 17.38±3.25＆＆19.63±2.92＆＆18.63±3.78＆＆22.38 ±3.07＆＆○○△◇◇20.38±3.54＆＆○18.75±1.75**18.38±3.93 21.75±2.12#●31.38±3.89##●●▲▲**27.13±1.46##●●▲◆**22.00 ±2.62#●●◆◆★★

3.2 脑组织病理观察

3.2.1 青年假手术组神经元常染色质丰富,胞质丰富,核仁较大,细胞器形态结构正常;神经胶质细胞较小,细胞质较少,胞核较小,异染色质多,细胞器形态结构未见异常;血管周围未见水肿,基底膜结构完整,内皮细胞形态结构未见异常。

3.2.2 青年模型组神经元、神经胶质细胞、血管内皮细胞总体变化趋势为脑缺血 3h胞质开始水肿,线粒体水肿,线粒体嵴和膜开始消失,内质网开始脱颗粒,核膜开始破坏,染色质浓缩及边缘聚集。I/R 1d逐步加重,I/R 3d超微结构破坏程度最重,表现为胞质高度水肿,线粒体高度水肿,线粒体嵴和膜大部分或全部消失,粗面内质网脱颗粒严重,细胞器减少,核膜部分溶解或消失,细胞核水肿。I/R 6d以后神经元、神经胶质细胞、血管内皮细胞超微结构破坏逐步减轻。到 I/R 12d后减轻的程度更明显,表现为胞质仅出现部分水肿,线粒体个别水肿或轻度水肿,线粒体嵴或膜部分消失,内质网未见明显改变,溶酶体形态基本正常,细胞核核膜结构基本完整,染色质边缘聚集。

在脑微血管超微结构变化方面,脑缺血 3h微血管周围开始轻度水肿,微绒毛开始减少,基底膜模糊,可见部分基底膜断裂,基底膜部分水肿。I/R 1d微血管周围水肿逐步加重,微绒毛消失,基底膜出现断裂、扭曲,部分基底膜溶解、缺损,内皮细胞沿着微血管纵向延伸、变形。I/R 3d血管周围高度水肿,基底膜大部分溶解、破坏,甚至消失,内皮细胞进一步变形,胞膜部分出现模糊,绒毛缺失。I/R 6d以后血管周围水肿逐步减轻,基底膜溶解和缺失较 I/R 3d减轻,到 I/R 12d血管周围仅有轻度水肿,内皮细胞吞饮泡减少,线粒体膜和嵴部分消失,基底膜仅见部分断裂。

3.2.3 老龄假手术组神经元、神经胶质细胞胞质内可见大量脂褐素,线粒体形态结构完整,无水肿,细胞核形态正常,核膜完整,染色质边缘聚集,核仁清晰。微血管周围未见水肿,微绒毛减少,内皮细胞线粒体结构基本正常,核周隙扩大,吞饮泡减少,血管基底膜完整。

3.2.4 老龄模型组神经元、神经胶质细胞、血管内皮细胞总体变化趋势为脑缺血 3h后胞质开始出现高度水肿,线粒体高度水肿,线粒体嵴和膜消失,内质网脱颗粒,核膜破坏,染色质浓缩及边缘聚集。上述改变持续加重,到 I/R 3d超微结构破坏达到最严重,胞质、胞核高度水肿,细胞周围水肿,线粒体水肿,嵴模糊、消失,排列紊乱,粗面内质网脱颗粒严重,游离核糖体大量减少,内有大量脂褐素,细胞器大量减少。I/R 6d以后超微结构破坏开始减轻,细胞质轻度水肿,线粒体轻度水肿,嵴部分或全部消失,粗面内质网轻度脱颗粒,细胞器间轻度水肿,有大量脂褐素。到 I/R 12d后减轻的程度更明显,仅有胞质轻度水肿,粗面内质网轻度扩张,核周轻度水肿,细胞器形态结构基本正常。

在脑微血管超微结构变化方面,脑缺血 3h微血管周围开始出现高度水肿,基底膜严重缺损,微绒毛减少,内皮细胞线粒体水肿,嵴、膜大部分消失,吞饮泡减少,粗面内质网脱颗粒;I/R 1d微血管周围水肿逐步加重,微绒毛消失,基底膜出现断裂、扭曲,部分基底膜溶解,缺损;I/R 3d后微血管变化达到高峰,基底膜大部分溶解、破坏,甚至消失,内皮细胞胞膜缺损,绒毛缺失;I/R 6d以后血管周围及基底膜水肿逐步减轻,基底膜缺失较 I/R 3d减轻;到 I/R 12d血管周围仅有轻度水肿,内皮细胞吞饮泡减少,线粒体膜和嵴部分消失,基底膜仅见部分扭曲变形。

4 讨论

近年来,从整体水平及细胞分子水平,就缺血性脑血管病的病理生理进行的实验多以青年动物为研究对象[6～8],忽视了增龄因素在缺血性脑血管病中的重要性,致使研究结论与缺血性脑血管病多发于老龄人群的临床实际相距甚远[9]。此现象逐步受到人们的关注,通过对大量临床病理材料观察及研究发现,老龄人群自身病理生理特点在缺血性脑血管病临床发病和预后等方面与青年有很大差异,增龄对缺血性脑血管病病理生理有显著影响[1]。作为缺血损伤后脑保护重要手段之一的“促血管生成”,其过程亦与年龄因素密切相关[10,11]。因此,明确青年与老龄血管生成特点的不同,探讨年龄因素对血管生成的影响作用意义重大。据此,我们选择具有脑血管解剖结构和功能与人类相近似、种内纯合性好、便于进行统计学处理、价廉易得等优点的 SD雄性大鼠作为实验动物;制作具备局部条件易控制、对全身影响小、可模拟临床脑缺血患者的各种症状等特点,且对评价药物的疗效、临床观察等都有极强的说服力的 MCAO局灶性脑缺血模型。通过对脑 MVD、血管场面积、神经细胞凋亡数及脑组织病理改变的观察,探讨老年脑缺血/再灌注后脑微血管生成的规律。目前体内外实验均证实[12,13],血管生成包括基底膜选择性降解,内皮细胞分裂、迁移,新的血管重塑及有效血管形成等过程,基底膜降解是血管生成的最初阶段。一方面,基底膜降解使血液中的大分子物质如纤维蛋白原进入细胞外基质中,形成纤维蛋白凝胶,细胞外纤维蛋白作为暂时性基质允许和支持新生血管及基质细胞的内向性生长,有利于血管形成;另一方面,通透性的增加亦可破坏内皮细胞间紧密连接结构,使血脑屏障低通透性的动态平衡失衡,同时导致病变组织微血管结构破坏而血浆外渗,可加重缺血损伤后脑水肿的形成[14]。因此,血管生成是一个在动态平衡中的复杂调控变化过程,对此过程的深入了解既是全面认知血管生成复杂过程的重要途径,又可使我们进一步明确缺血性脑血管病的病理生理特点,研究意义重大。

MVD、血管场面积是表示微血管生成情况的重要指标。MVD为单位面积内血管的数量(用于表示血管数量),血管场面积为一个视野内所有微血管管腔面积阳性染色总和与背景视野面积的比值(用于表示血管管腔大小)。血管数量和管腔大小可有效地反映血流量及血管有效性,故对此两指标同时观察能较为全面地反映微血管生成全貌。本组资料表明,正常老龄大鼠 MVD较青年大鼠显著增高。此现象可能与老龄大鼠血管粥样硬化所致的血管腔逐步狭窄有关：老龄大鼠血管管腔狭窄导致血管有效供给量降低,脑组织长期受到缺血缺氧刺激,引起微血管代偿性增殖,微血管数量不断增加。此与 Marti研究结果基本吻合[15]。而于造模后呈现出的与青年大鼠微血管生成完全相反的 MVD逐步下降趋势则可能与脑缺血/再灌注后老龄大鼠损伤较重,同时老龄大鼠调节能力减弱、微血管增殖能力明显降低等方面有关。青年大鼠于脑缺血/再灌注后血管场面积大小虽出现一定波动,但整体上呈现出不断增加的趋势,与其 MVD变化规律基本一致,说明脑缺血损伤后青年大鼠不仅血管数量增多,血管腔径也有所增加,血液供给量明显改善。老龄模型组大鼠血管场面积于早期(I/R 1d)有轻微增加,此后却迅速降低,说明老龄大鼠脑 MVD降低的同时也伴随有血管腔径的明显减小,致使血液有效灌注量降低。值得注意的是,青、老模型组血管场面积于 I/R 1d达峰值后,至 I/R 6d这一时程均呈现出下降趋势,而此时段(I/R 1～6d)二者脑组织含水量亦处于较高水平。由此我们推测,脑组织水肿程度增高可能与缺血损伤后脑微血管场面积减小密切相关。此外,I/R 6d后青、老模型组脑水肿程度均明显改善,老龄模型组血管场面积无明显变化,而青年模型明显增大,这可能由于再灌注损伤后青年较老龄代偿能力强,故血管场面积明显改善。此现象的机制仍待深入研究。

在脑组织超微结构方面,正常青年与老龄大鼠的预后改善存在显著差异,主要表现为胞质内大量脂褐素,染色质边缘聚集,微血管微绒毛减少,核周隙扩大,老龄大鼠出现明显退行性改变。经 MCAO造模后脑缺血/再灌注青年、老龄大鼠梗死区超微结构共同变化主要表现在胞质水肿,线粒体水肿,嵴、膜溶解或消失,粗面内质网脱颗粒,核膜破坏,细胞器减少,微血管水肿,微绒毛减少或缺失,基底膜断裂、扭曲,内皮细胞变形。青年与老龄模型组大鼠超微结构动态变化总趋势为脑缺血 3h～I/R 6d是疾病发生发展期,I/R 6d以后组织病理改变逐渐好转。老龄大鼠病理损伤较青年大鼠出现早,且程度严重。

细胞凋亡方面,老龄假手术组及老龄模型组I/R 3d、6d凋亡细胞数较青年组显著增多(P＜0.01)。青、老模型组凋亡细胞数均于脑缺血 3h明显增加,老龄大鼠于 I/R 3d达到峰值;青年大鼠 I/R 6d达到峰值,老龄大鼠早于青年大鼠。

通过对上述指标综合分析我们不难看出,青年大鼠细胞凋亡程度轻且发生较缓,脑细胞超微结构破坏不明显,故随着脑缺血/再灌注时间的延长,其脑微血管生成呈现出逐渐增多趋势;老龄大鼠细胞凋亡程度重且发生明显早于青年大鼠,脑细胞超微结构破坏显著,因此脑微血管生成表现出随缺血/再灌注时间延长而逐渐减弱的趋势。由此可见,脑缺血/再灌注脑损伤程度与脑微血管生成情况密切相关。老年脑缺血/再灌注脑微血管生成明显弱于青年,增龄变化可能是影响老年上述脑微血管病理特点的重要因素。

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