动态浊度法定量测定甘草酸二铵注射液细菌内毒素的含量

2010-09-18苏惠虹沈小卓张小薇

长春中医药大学学报 2010年1期

关键词：二铵内毒素甘草酸

苏惠虹,沈小卓,张小薇

（广州市医药职业学校广东广州 510430）

动态浊度法定量测定甘草酸二铵注射液细菌内毒素的含量

苏惠虹,沈小卓,张小薇

（广州市医药职业学校广东广州 510430）

目的建立甘草酸二铵注射液的细菌内毒素定量检查方法,控制药品质量。方法采用动态浊度法,对甘草酸二铵注射液进行干扰预实验、干扰实验定量检测。结果甘草酸二铵注射液在16倍稀释时无干扰作用。结论用该法检测甘草酸二铵注射液中的内毒素含量,结果准确,可替代家兔法。

动态浊度法;细菌内毒素;甘草酸二铵注射液

甘草酸二铵注射液为中药注射剂,其活性成分为甘草中的甘草次酸左旋构型,是甘草有效成分的第三代提取物,具有较强的抗炎、保护肝细胞膜及改善肝功能的作用。在临床上用于伴有谷丙氨基转移酶升高的急、慢性病毒性肝炎的治疗。该品种目前《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）（2005版）二部[1]并未收载其热原检查方法。国内曾有学者试验用鲎试剂凝胶法检测其细菌内毒素[2-6],而采用动态浊度法未见有报道。笔者参照2005年版《中国药典》二部细菌内毒素检查法进行试验,在原用凝胶法试验法的基础上探讨动态浊度法检测甘草酸二铵注射液细菌内毒素的可行性,以期建立定量检测方法。

1 材料与方法

1.1 试剂

1.1.1 动态浊度法鲎试剂（TAL）规格 1.2 mL/Amp,湛江安度斯生物有限公司,批号0610230,可测内毒素范围:10～0.03 EU/mL。

1.1.2 细菌内毒素工作标准品规格150 EU/Amp,中国药品生物制品检定所,批号2007-1。

1.1.3 细菌内毒素检查用水（BET水）规格25 mL/Amp,湛江安度斯生物有限公司,批号0701310。

1.1.4 甘草酸二铵注射液规格10 mL/Amp,批号0704072、0704182、0903132,江苏正大天晴药业股份有限公司。

1.1.5 ATi/LKL 动态试管分析仪,由 lab Kinetics Ltd（英国）生产,湛江安度斯生物有限公司总代理;ZH-2自动旋涡混合器,天津药典标准仪器厂生产;GZX-9246 MBE数显鼓风干燥箱,上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产。实验所用玻璃仪器经250℃干烤1 h除去外源性内毒素。

1.2 方法

1.2.1 细菌内毒素限值（L）的确定根据药品细菌内毒素限值:L=K/M,K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量,甘草酸二铵注射液内毒素的阈剂量K=5.0 EU/（kg◦h）;M 为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量,甘草酸二铵注射液的M=0.5 mL/kg（本品人用量为1日1次150 mg、30 mL,取人体平均体重为60 kg）,则甘草酸二铵注射液细菌内毒素限值L=K/M=5.0 EU/（kg◦h）/0.5 mL/（kg◦h）=10 EU/mL。

1.2.2 甘草酸二铵注射液最大有效稀释倍数（MVD）的确定按公式MVD=L/λ,其中L为甘草酸二铵注射液内毒素限值（10 EU/mL）;λ为标准曲线的最低内毒素浓度（0.03 EU/mL）,则甘草酸二铵注射液的最大有效稀释倍数MVD为333倍。

1.2.3 标准曲线的制备及可靠性试验用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品进行2～10倍稀释,使其最终浓度分别为2.0,0.25,0.03 EU/mL,各取0.1 mL分别加到预先装有0.1 mL鲎试剂反应管内,混合均匀,插入设置好的32通道动态试管仪内进行检测,其中每一浓度重复3管,并同时取0.1 mL细菌内毒素检查用水加到装有0.1 mL鲎试剂反应管内作阴性对照（2管）,当对照管结果不超过标准曲线最低浓度（0.03 EU/mL）时,用测得的反应时间（T）对数值与对应的细菌内毒素浓度（C）对数值,即lgT对lgC进行回归分析,结果见表1。

回归方程:lgT=0.977 607-0.265 876 lgC,|r|=0.997 930,最低标准内毒素浓度为0.03 EU/mL,反应时间474.0～1 449.0 s,阴性对照反应时间＞3 600 s,在检测时间外,变异系数CV（%）≤10%,故标准曲线成立。

表1 标准曲线的可靠性分析

1.2.4 干扰预实验甘草酸二铵注射液的最大有效稀释倍数 333倍 ,本文仅对 1∶8、1∶16、1∶32、1∶64 倍 4个系列浓度进行干扰实验。方法是将供试品用内毒素检查用水稀释成 1∶8、1∶16、1∶32、1∶64 倍 4 个系列浓度,在每个浓度下分别取0.1 mL样品加入0.1 mL鲎试剂作为样品检查（NPC）;用对半互稀释法（50/50）∶如 0.5 mL S4+0.5 mL E0.5（混匀）→0.1 mL S8E0.25,其中E0.25为标准曲线的中点浓度,制备各浓度稀释液的阳性对照样品,分别取各浓度阳性对照0.1 mL加入0.1 mL鲎试剂作为样品阳性对照（PPC）。各浓度样品及PPC溶液分别平行两组,插入设置的动态试管仪内进行检测,另外还按标准曲线制作方法制备标准曲线及阴性对照（NC）,结果1∶8浓度的样品,其回收率超过《中国药典》（2005版）规定,回收率不在50～200%范围内,表明有干扰作用。而1∶16、1∶32和1∶64倍系列稀释浓度样品回收率均在50～200%范围内,且变异系数（CV）均小于10%,标准曲线|r|≥0.980,NC反应时间＞3 600 s。综合以上情况,决定采用1∶16、1∶32、1∶64倍稀释液进行干扰实验。

1.2.5 干扰实验为确证 1∶16、1∶32、1∶64倍稀释液的有效性,进行三个批号甘草酸二铵注射液（0704072、0707182、0903132）正式干扰试验。其具体操作同1.2.4。结果见表2。

批号0704072回归方程lgT=1.004 681-0.281 457 lgC,|r|=0.998 040;批号0707182回归方程lgT=0.799 221-0.325 610 lgC,|r|=0.998 835;批号0903132回归方程lgT=0.906 868-0.481 056 lgC,|r|=0.987 902。根据《中国药典》（2005版）规定,如果药品阳性对照中内毒素的回收率在50～200%范围之间无干扰,标准曲线|r|≥0.980,变异系数（CV%）≤10%,阴性对照（NC）测出内毒素含量小于标准曲线最低浓度λ（本实验为0.03 EU/mL）,有效。表2结果表明:3批供试品在16倍、32倍和64倍稀释时均无干扰作用,可以进行定量检测。

2 结果与结论

甘草酸二铵注射液1∶8倍稀释对细菌内毒素定量检查法有干扰,但经稀释后可以消除干扰作用。本实验3批样品经16倍、32倍和64倍稀释后,依法进行细菌内毒素定量法检查,其PPC的内毒素回收率均在50%～200%,结果符合药典规定。检测结果和其它热原检查的结果一致。证明甘草酸二铵注射液不仅可以用家兔法进行热原检查,有学者亦成功用凝胶法进行检查实验,而只要将样品稀释成16倍、32倍和64倍稀释液更可用动态浊度法进行定量检查。实践证明,动态浊度法是可行的,该法不仅比其它方法灵敏度高,重现性好,更能标准化,迅速得出结果,能更好的在药品的生产中全程监控药品的质量,值得推广应用。