青莪汤对Lewis肺癌小鼠MMP9、Ang-Ⅱ、EGF、微血管密度的影响
2010-09-18谭祥华黄秀深植品隆杨光富
谭祥华,黄秀深,植品隆,杨光富
（成都中医药大学,四川 成都 610075）
青莪汤对Lewis肺癌小鼠MMP9、Ang-Ⅱ、EGF、微血管密度的影响
谭祥华,黄秀深,植品隆,杨光富
（成都中医药大学,四川 成都 610075）
目的通过检测C57/BL荷瘤小鼠的基质金属蛋白酶（MMP9）、血管紧张素（Ang-Ⅱ）、表皮生长因子（EGF）的含量,观察青莪汤对Lewis肺癌的生长、肿瘤微血管生成及转移的影响。方法以C57/BL荷瘤小鼠为研究对象,以顺铂为阳性对照,以生理盐水为阴性对照,观察青莪汤各剂量组对Lewis肺癌的MMP9、Ang-Ⅱ、EGF、微血管密度的作用。结果青莪汤的低剂量能抑制Lewis肺癌的生长,且能抑制Ang-Ⅱ、EGF的活性,与模型组比较（P＜0.05）,青莪汤各剂量组均能抑制MMP9的活性,与模型组比较（P＜0.01）。青莪汤的中、低剂量、顺铂组能显著抑制肿瘤微血管的生长,与模型对照组比较（P＜0.001）。结论青莪汤能抑制Lewis肺癌的转移,其机制可能与抑制MMP9、Ang-Ⅱ、EGF的活性,降低肿瘤的微血管密度有关。
青莪汤;MMP9;Ang-Ⅱ;EGF;微血管密度;大鼠
青莪汤由青蒿、莪术等中药材组成,为成都中医药大学方剂教研室研制的经验方,其在临床治疗肿瘤方面具有很好的疗效。本实验采用Lewis肺癌自转移模型,选择了MMP9、Ang-Ⅱ、EGF、微血管密度作为研究指标,探讨青莪汤对Ang-Ⅱ 、MMP9、EGF、微血管密度在肺癌侵袭和转移中的可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料 Lewis肺癌瘤株,购自四川大学动物实验中心。健康C57小鼠（20±2）g,雌雄各半,购自四川大学动物实验中心,合格证号:SCXK-09-2006。青莪汤中青蒿、莪术等中药,购于北京同仁堂成都总府店,水煎成含1 mL/g。顺铂注射液,江苏豪森药业有限公司生产,生产批号090104。血管紧张素（AngiotensinⅡ）试剂盒,美国RD公司产品。表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）试剂盒,美国RD公司产品。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMP9）试剂盒,美国RD公司产品。
1.2 方法
1.2.1 动物试验 取接种Lewis肺癌瘤株10～14 d的C57/BL荷瘤小鼠,脱颈椎处死,无菌条件下取瘤组织,按肿瘤质量（g）与生理盐水（mL）1∶3制备瘤细胞悬液,另取C57/BL小鼠50只（20±2）g,雌雄各半,全部小鼠均于右腋下接种Lewis肺癌瘤细胞悬液,每只0.2 mL,再随机分为空白对照组、阳性对照组、青莪汤高剂量组、中剂量组、低剂量组,每组10只,于接种后第2 d开始给药,青莪汤低、中、高剂量组均给予0.2 mL/只,青莪汤剂量见表1～表5,其相当于临床成人用量的5倍、10倍、20倍。空白组给予生理盐水0.2 mL/只,连续给药18 d[1],顺铂组予以腹腔注射,隔日给药1次,共给药5次,给药剂量以生药量计算,见表1～表5。于20 d眼球取血,离心,取小鼠血清进行MMP9、Ang-Ⅱ、EGF检测。处死小鼠,剥取肿瘤进行抑瘤率的检测。剥取肿瘤及肺组织进行微血管密度检测。
1.2.2 抑瘤率的检测 眼球取血,处死小鼠,剥离肿瘤,称重。
抑瘤率=（平均空白组瘤重-平均青莪汤组瘤重）/平均空白组瘤重×100%
1.2.3 MMP9的检测 取小鼠血清,用ELISA法,用试剂盒进行检测。
1.2.4 Ang-Ⅱ的检测 取小鼠血清,用ELISA法,用试剂盒进行检测。
1.2.5 EGF的检测 取小鼠血清,用ELISA法,用试剂盒进行检测。
1.2.6 肿瘤及肺微血管密度的检测 肿瘤组织微血管密度（MVD）检测取部分肿瘤组织,4%多聚甲醛固定,F8常规免疫组化染色,在显微镜下记数10个视野内肿瘤微血管数目,以平均每高倍镜（×200）视野的微血管个数表示MVD[2-3]。
1.3 统计学分析 采用SPSS 15统计软件进行分析,抑瘤率采用公式:（对照组瘤重-实验组瘤重）/对照组瘤重,分别计算之后进行方差分析,MMP9、Ang-Ⅱ、EGF、微血管密度均采用方差分析。
2 结果
2.1 青莪汤对Lewis肺癌小鼠抑瘤率的影响 见表1。
表1 青莪汤对Lewis肺癌小鼠抑瘤率的影响（±s,n=10）
表1 青莪汤对Lewis肺癌小鼠抑瘤率的影响（±s,n=10）
注:与模型组比较,#P＜0.05,##P＜0.01。
组 别 给药途径/（g/kg） 瘤重 抑瘤率/%剂量模 型 对 照 组 ig — 7.280 4±2.227 9 —顺 铂 组 ip 0.02 1.324 3±1.321 8## 81.81青莪汤低剂量组 ig 1.00 3.958 5±1.866 2# 45.63青莪汤中剂量组 ig 5.00 6.791 0±2.578 5 6.72青莪汤高剂量组 ig 10.00 7.440 5±1.942 0 —
2.2 青莪汤对C57/BL荷瘤Lewis肺癌小鼠MMP-9的影响 见表2。
表2 青莪汤对 Lewis肺癌小鼠MMP-9的影响（±s,n=10）
表2 青莪汤对 Lewis肺癌小鼠MMP-9的影响（±s,n=10）
注:与模型组比较,###P＜0.001。
组 别 给药途径给药剂量/（g/kg）MMP9/ug模 型 对 照 组 ig — 73.098 7±17.193 4顺 铂 组 ip 0.02 32.573 5±27.730 0###青莪汤低剂量组 ig 1.00 20.259 5±9.179 8###青莪汤中剂量组 ig 5.00 28.670 1±15.483 3###青莪汤高剂量组 ig 10.00 31.915 9±11.423 7###
2.3 青莪汤对Lewis肺癌小鼠Ang-Ⅱ的影响 见表3。
表3 青莪汤对Lewis肺癌小鼠Ang-Ⅱ的影响（±s,n=10）
表3 青莪汤对Lewis肺癌小鼠Ang-Ⅱ的影响（±s,n=10）
注:与模型组比较,##P＜0.01。
组 别 给药途径给药剂量/（g/kg）Ang-Ⅱ/（ng/L）模 型 对 照 组 ig — 649.7045±175.647 3顺 铂 组 ip 0.02 692.557 6±82.963 1青莪汤低剂量组 ig 1.00 437.671 3±44.709 6##青莪汤中剂量组 ig 5.00 511.470 8±57.752 8青莪汤高剂量组 ig 10.00 424.542 7±30.432 6
2.4 青莪汤对Lewis肺癌小鼠EGF的影响 见表4。
表4 青莪汤对Lewis肺癌小鼠EGF的影响（±s,n=10）
表4 青莪汤对Lewis肺癌小鼠EGF的影响（±s,n=10）
注:与模型组比较,###P＜0.001。
组 别 给药途径给药剂量/（g/kg）EGF/（ng/L）模 型 对 照 组 ig — 276.656 4±55.421 3顺 铂 组 ip 0.02 203.386 5±44.155 0青莪汤低剂量组 ig 1.00 211.037 2±77.055 3###青莪汤中剂量组 ig 5.00 200.443 9±40.024 6青莪汤高剂量组 ig 10.00 203.386 6±44.156 6
2.5 青莪汤对Lewis肺癌小鼠微血管密度的影响见表5。
表5 青莪汤对Lewis肺癌小鼠微血管密度的影响（±s,n=10）
表5 青莪汤对Lewis肺癌小鼠微血管密度的影响（±s,n=10）
注:与模型组比较,##P＜0.01,###P＜0.001。
组 别 给药途径剂量/（g/kg） 瘤血管数 肺血管数模 型 对 照 组 ig — 45.700 0±18.064 5 44.558 8±13.366 6顺 铂 组 ip 0.02 21.600 0±6.350 0###24.833 3±5.408 1###青莪汤低剂量组 ig 1.00 27.166 7±7.543 3###26.233 3±7.784 5###青莪汤中剂量组 ig 5.00 36.933 3±8.509 4## 36.520 0±8.832 3###青莪汤高剂量组 ig 10.00 48.500 0±12.050 3 59.300 0±18.046 2
3 讨论
肺癌属于中医“肺积”“息贲”等范畴。气（气滞）、痰（痰凝）、瘀（血瘀）、毒（毒聚）、虚（正气亏虚）是其基本病因。肺癌患者多表现为气阴两虚、邪毒内聚、瘀血阻滞,临床多以清热解毒、益气养阴、活血化瘀为主要大法辨证论治。青莪汤由人参、青蒿、莪术、三七等药物组成。全方配伍精良,祛邪而不伤正、扶正而不留邪。具有益气活血、化瘀散结之功,体现了中医辨证论治的原则,在临床运用中收效良好。
本实验结果表明,青莪汤能抑制肿瘤的发生和生长,其抗癌能力与剂量呈一定的负相关,其作用机理可能与下调MMP9、EGF、Ang-Ⅱ有关。本实验结果与临床疗效一致[4-5],为青莪汤的临床运用提供了实验依据,也为进一步研发本方提供了实验基础。青莪汤能降低MMP9的含量,但本实验研究结果表明,青莪汤仅在低剂量时,具有抑瘤作用和下调Ang-Ⅱ、EGF的作用,中、高剂量作用不明显,甚至高剂量具有促进肺血管生成作用,可能与样本含量较少有关。笔者认为,在进一步的临床与实验研究过程中,应选取合适的剂量,增大样本量,采用不同的给药途径、不同的模型,并与体外实验相结合,更深一步研究青莪汤抗肿瘤的作用机理。
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[1]Weidner N.Current pathologic methods for measuring intratumoralmicrovessel density within breast carcinoma and other solid tumors Breast Cancer Res Treat,1995,36（2）:169-180.
[2]陈龙邦,槠晓源,王靖华,等.非小细胞肺癌MMP2和MMP9的表达及其意义[J].江苏医药杂志,2001,27（3）:676-677.
[3]邓红彬,张幸平,刘宇.非小细胞肺癌P53、VEGF、MVD的表达及其相关性[J].肿瘤防治研究,2005,32（1）:702-704.
[4]Abali H,Gtilliia IH,Engina H,et a1.Old antihypertensivesas novel antineoplastics”angiotensin-I-converting enzymeinhibitors and angiotensin II type 1 receptor antagonists[J].Med Hypotheses,2002,59（3）:344-348.
[5]Fujimoto Y,Sasaki T,Tsuchida A,et a1.Angiotensin IItype 1 receptor expression in human pancreatic cancerand growth inhibition by angiotensin II type 1 receptorantagonist[J].FEBS Lett,2001,495（3）:197-200.
R285.5
A
1007-4813（2010）01-0014-02
（
2009-12-01）
