结核分支杆菌链霉素耐药基因的杂交检测

韩中波

链霉素(Sm)作为最主要的一线抗结核药物之一,但由于单纯化疗和不规律化疗,其耐药情况日益严重,对其耐药性的研究受到重视。[1]有报道认为结核分支杆菌耐链霉素的产生是由于其核糖体蛋白 S12编码基因 rpsL和 16SrRNA的编码基因 rrs的缺失和突变所导致[2]。本院采用采用 PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术检测了 55株肺结核患者痰标本临床分离株,并对 25例结核患者痰标本直接进行 rpsL基因、rrs基因突变检测,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 23例敏感株和32例耐 SM或含耐SM的临床分离株来自本所。25例耐 SM或含耐SM的肺结核患者痰标本来自本院住院结核患者。按结核病诊断细菌学规程进行菌种鉴定及药敏实验证实为结核分支杆菌并对链霉素耐药。

1.2 方法

1.2.1 细菌 DNA的制备[3]临床分离株 DNA用常规酚/氯仿抽提法提取标本中 DNA。

1.2.2 PCR扩增 采用 25μl反应体系,4XdNTPs终浓度为0.2mmol/L,Bio-标记引物终浓度为 0.2μmol/L,扩增程序为:94℃变性 Imin,58℃退火 1min,72℃延伸 Imin,循环 30次,最后 72℃延伸 10min。扩增产物经 2%琼脂糖凝胶电泳。紫外检测出现 267bp条带。

1.2.3 杂交检测 将点有探针的硝酸纤维素膜装入杂交袋中,加入杂交液放置水浴锅中进行预杂交:45℃×30min。将Bio-标记引物的 PCR扩增阳性产物变性:95℃×l0min,取出迅速放入冰盒中,每毫升杂交液一般加 l0μl变性的扩增产物,放置水浴锅中进行杂交:45℃ ×30min。洗膜:洗液 1、45℃ × 3min,洗液 2、45℃×3min。 SA-AP:用 1∶1000的稀释液(洗液Ⅰ)与膜在 37℃作用 30min。洗膜:洗液Ⅰ、45℃×3min,洗液Ⅱ、45℃×3min。显色:每毫升洗液 I加入 NBT 6.6μl、BICP3.3μl混匀,将配好的显色液加入杂交袋中,闭光 37℃显色 5min,观察结果。

2 结果

2.1 PCR扩增,以结核分支杆菌 H37RV为对照,23株药物敏感株、32株耐 SM分离株 rpsL、rrs基因扩增均为阳性;25例耐 SM肺结核患者痰标本中 rpsL基因 18例扩增阳性、rrs基因 14例扩增阳性(见表 1)。

2.2 应用寡核苷酸探针反相斑点杂交技术检测 rpsL、rrs基因突变结果(见表 1、2)。

表1

表2 对 55例临床分离株的检测结果(%)

23株药物敏感株的rpsL、rrs基因突变率分别为 4.3%、0。32株耐 SM分离株中,21株 rpsL基因发生突变,突变率为65.6%;4株 rrs基因发生突变,突变率为 12.5%。耐 SM肺结核患者痰标本中,基因突变检测率分别为 50.0%、7.2%。

3 讨论

迄今,检测结核杆菌药敏的传统方法仍然是培养法,但由于结核杆菌生长缓慢,使药敏测定结果需要两个月,甚至更长时间,这也是影响结核病化疗效果的原因之一。因此,建立一种新的快速,有效的药敏试验方法对结核病的早期治疗具有重要的意义。有研究表明[4]结核分支杆菌耐链霉素的产生是由于其核糖体蛋白S12编码基因rpsL和 16SrRNA的编码基因rrs的缺失和突变所导致。本实验室前期通过PCR-SSCP方法得出耐链霉素时,rpsL、rrs基因总突变率为 72.2%。[4]但PCR-SSCP方法建立在凝胶电泳基础上,难于标准化和质量控制,难以大规模推广。通过对rpsL、rrs基因核心易变区进行DNA序列分析。根据基因突变的中心区域,设计靶基因,制备寡核苷酸探针,点样在杂交膜上,进行PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交。

PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交检测 rpsL、rrs基因突变,23株药物敏感株的 rpsL、rrs基因突变率分别为 4.3%、0。32株耐 SM分离株中,21株 rpsL基因发生突变,突变率为65.6%;4株 rrs基因发生突变,突变率为 12.5%。由于有4.3%的敏感株也突变,说明某些耐药菌株的形成可能与rpsL、rrs突变无关。

笔者用PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术直接检测了 25例耐SM肺结核患者痰标本,rpsL基因 18例扩增阳性、rrs基因 18例扩增阳性,其基因突变检测率分别为 50.0%、7.2%。低于耐 SM临床分离株。这可能是由于痰标本杂质多,同时痰标本的处理和靶DNA浓度对 PCR扩增有直接影响。PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术以其简便、快速、灵敏并可以直接检测未经培养的痰标本中结核分支杆菌rpsL、rrs基因突变,为临床检测结核分支杆菌对链霉素耐药性提供了初步依据。

[1] Marttuke GJ,Soini H,Vyhneueskiy B.Rapid detection of rifampinresistant.mycobacterium trberoulosis by Sequencing and line probe assay.Scand JInfect Dis,1998,30(2):129-132.

[2] Morris S,Bai GH,Suffys P,et al.Molecular mech anism ofmultiple drug resistance in clinical isolates of mycobacterium trberoulosis.JID,1995,171(4):954-957.

[3] SmallScale Mycobacterial hromosomalDNA extraction.MRC,1995.

[4] 张小刚,李书琳,等.结核分支杆菌耐链霉素耐药基因的检测.实用医学杂志,2001,17(10):1006-1007.