青荚叶多糖的提取及含量测定

李双妹

（濮阳职业技术学院 石油化工与环境工程系，河南 濮阳 457001）

青荚叶多糖的提取及含量测定

李双妹

（濮阳职业技术学院 石油化工与环境工程系，河南 濮阳 457001）

为了开发青荚叶资源，采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量，测得多糖的含量为274.3μg/g。苯酚-硫酸法测定多糖的方法简便、灵敏、准确。青荚叶中含有较丰富的多糖，具有广阔的开发应用前景。

多糖；苯酚-硫酸法；青荚叶

0 引 言

青荚叶（Helwingia japonica）为茱萸科青荚叶属，又称叶上珠、叶上花，甘南州群众俗称叶里开花，又名大部参、阴证药、叶长花，因花着生于叶上面的中脉(近于基部)而得名。苗族药名枪墙叶，多生于林下阴处，分布于贵州中西部各苗乡。根茎叶入药，具有舒筋活络、调经、清热除湿、解毒消肿、凉血止血、清肺止咳等功效，并具有清热利尿、下乳等功能。苗族民间常以叶上花、无花果、月季花搭配治疗月经不调，以叶上花、矮陀陀、土三七搭配治疗劳伤，单用叶上花来治疗年久咳喘[1]。由于青荚叶中含有肉桂酸和西米杜鹃醇等有机成分，因而可用于提取肉桂酸，用来合成治疗冠心病的重要药物，还可用做合成保鲜剂等[1]。因此，在食品、医药、化工等行业有着广泛的用途,是一种极其丰富而宝贵的自然资源。

多糖作为药用始于20世纪40年代，近年来多糖类物质是国内外研究的热点之一。我国学者王开发等对5种植物的多糖进行提取和研究认为，多糖不但能治疗机体的免疫缺陷疾病，还能治疗诸如风湿之类的自身免疫性疾病，并且具有抗氧化及抗衰老作用[2]。但对青荚叶多糖的研究还鲜有报道，因而对青荚叶多糖的研究具有重要的科学价值。青荚叶中含有丰富的多糖，运用改进的苯酚-硫酸法测定青荚叶多糖的含量，可以为进一步合理开发青荚叶资源提供理论依据。

1 材料

1.1 样品来源及前期处理

青荚叶于2009年6月采自三门峡市卢氏县。用万能植物粉碎机将自然晾干的青荚叶粉碎成粉末状，过40目筛。青荚叶中脂肪含量未知，脂肪的存在会影响其多糖的分析，应先将青荚叶中的脂肪提取出来，以取得较好的效果。

用索式提取器提取脂肪：恒重滤纸（脱脂后的滤纸）筒，然后称其质量m1。恒重是指物品经连续两次加热干燥，冷却后称得其质量相差不超过规定量，一般规定为0.2～0.3mg。称取青荚叶样品，全部移至已恒重过的滤纸筒内，称得其总质量m2。将滤纸筒放入脂肪提取器的抽提筒内，连接已干燥的接收瓶，由抽提器冷凝管上端加入无水乙醚至容积的2/3处，于75℃水浴上加热，使乙醚不断回流提取（12次/h），抽提5h。提取结束时检查脂肪是否提取完全的方法为，用玻璃棒蘸取抽提管中的乙醚一滴滴在滤纸上，乙醚挥发后无油迹即可。冷却至室温后，自上而下拆除抽提器，把单口烧瓶和滤纸筒放实验室自然风干。称取风干后的滤纸筒与青荚叶样品的总质量m3。将风干后的青荚叶样品移入干净的滤纸（脱脂后）中，放入干燥器中储存备用。青荚叶的脂肪含量按以下公式计算：

青荚叶的脂肪含量见表1。

表1 青荚叶的脂肪含量

1.2 仪器及试剂

（1）仪器。万能植物粉碎机，722型分光光度计，索式提取器，量筒（100ml），电子分析天平，圆底烧瓶，冷凝管，铁架台，电子恒温水浴锅，SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵抽滤装置，滤纸，RE-2000旋转蒸发器（上海荣生），循环式多用真空泵，XK96-B快速混匀器，离心机，吸量管，分液漏斗，烧杯，吸管，玻璃棒，具塞比色管（25ml，50ml），微量取液器（100μl），吸耳球，漏斗，UV-1601型分光光度计，容量瓶，称量瓶，烘箱，Zeeman偏振效应背景校正器，Tech -315A型电热板，锥形瓶，漏斗。

（2）试剂。浓硝酸，葡萄糖，苯酚，浓硫酸，无水乙醚，石油醚，氯仿，正丁醇，95%乙醇，无水乙醇，La2O3，盐酸，以上均为分析纯；高氯酸（G·R），去离子水，高纯水；试验中所用玻璃器材均用HNO3（20%）浸泡24h以上，再用去离子水冲洗干净，烘干后防尘储藏备用。

2 方法与结果

2.1 苯酚试液的配制

基于不确定测度的电力系统抗差状态估计:(二)模型方法//陈艳波,谢瀚阳,王鹏,王金丽,刘进,王若兰//(2):26

用电子分析天平精确称取苯酚10g于棕色瓶中，加150ml去离子水溶解，振荡摇匀，贴上标签备用（临用前配制）[3]。

2.2 葡萄糖标准溶液的配制

精确称取经105℃干燥至恒重的分析纯葡萄糖100mg,置于100ml容量瓶中加去离子水溶解并稀释至刻度，摇匀，配成浓度为1×103mg/l的标准葡萄糖溶液备用。精确量取葡萄糖标准溶液(1×103mg/l)0μl，100μl于25ml具塞比色管中，加蒸馏水至2.0ml，再分别加苯酚溶液1.0ml，摇匀，迅速加入浓H2SO4溶液5.0ml，摇匀后室温放置5min，置沸水浴中加热15min，取出冷却至室温；在UV-1601型分光光度计上，以相应的试剂为空白，于400～600nm处每隔5～10nm测定一次吸光度，得λmax=490nm。其测定结果见表2、图1。

图1 葡萄糖标准溶液不同波长下的吸收光谱曲线

2.3 标准曲线绘制[4]

精确量取葡萄糖标准溶液(1×103mg/l)0μl，10μl，20μl，40μl，60μl，80μl，100μl于25m1具塞比色管中，加蒸馏水至2.0ml，再分别加苯酚溶液1.0ml，摇匀，迅速加入浓H2SO4溶液5.0ml，摇匀后室温放置5min，置沸水浴中加热15min，取出冷却至室温；在UV-1601型分光光度计上，以相应的试剂为空白，于490nm处测定吸光度。其测定结果见表3、图2。将实验数据作回归处理得回归方程：A=0.050416C-0.00862，r=0.9997。

2.4 多糖的提取及精制

表3 葡萄糖标准溶液下不同容积的吸光度值

图2 葡萄糖标准曲线

用电子分析天平精确称取三份脱脂后的青荚叶分别为3.9750g、1.0004g、1.0004g，置于圆底烧瓶中，分别加入120ml去离子水，于90℃水浴中加热（至水浴温度升高开始计时）1h。把脱脂后的滤纸剪好置于抽滤瓶的漏斗中，将提取液趁热进行抽滤。用旋转蒸发仪（50℃，90rpm）旋转蒸发，将抽滤液中去离子水除去，使滤液减压缩至6ml左右。将减压浓缩后的溶液移入离心管中，加入20ml氯仿-正丁醇混合溶剂（4:1），用XK-96B快速混匀器剧烈振荡20min，放入离心机中离心（3000r/min）10min，离心后于分液漏斗中萃取，弃去中间层的变性蛋白质及下层的有机液，保留上清液于干净的小烧杯中（连续离心萃取3次）[5]。用电子分析天平精确称取1.0000g活性炭倒入烧杯中，用试管夹固定烧杯于沸水浴中加热，并用玻璃棒不断搅拌。然后过滤，将活性炭除去。连续脱色两次，得青荚叶多糖。

精确称取青荚叶多糖50mg，置于100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀制得青荚叶多糖储备液，吸取储备液200μl，按照标准曲线制备的方法测定吸光度，在UV-1601型分光光度计上，以相应的试剂为空白，于489.5nm处测定吸光度，与标准溶液的最大吸收波长相近，推测为多糖。其测定结果见表4、图3。

从吸收光谱标准曲线中求出供试液中多糖的含量，按以下公式计算：

其中，m为多糖的质量（mg），ρ为供试液中多糖的浓度（mg/l），v为供试液的体积（ml），d为多糖的稀释因素[6]；吸光度为0.2292，相应的葡萄糖浓度为4.72mg/l，换算因素F=10.59。

表4 样品溶液不同波长下的吸光度值

图3 吸收光谱标准曲线

2.6 样品的测定

从烧杯中吸取50μl的样品液，加去离子水定容于50ml具塞比色管中，用微量取液器吸取2ml稀释液，加苯酚试液1.0ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0ml，摇匀后放置5min，置沸水浴中加热15min，取出冷却至室温，另以蒸馏水2.0ml，加苯酚和硫酸，与上述操作做空白对照。用UV-1601型分光光度计于489.5nm处测定吸光度[7]。其测定结果见表5。从图2葡萄糖标准曲线中求出样品液中多糖的含量，按以下公式计算：

多糖含量=ρvdF/m

其中，ρ为样品溶液中多糖的浓度（mg/l），v为样品溶液的体积（ml），d为样品的稀释因素，F为换算因素，m为样品的质量（mg）。

2.7 精密度试验

（1）仪器的精密度试验。将提取的多糖样品液重复测定5次，求其相对标准偏差（RSD）。结果显示，所测定RSD为0.0355%，说明此仪器的精密度较高。其试验结果见表6。

表6 青荚叶多糖含量测定精密度试验结果(N=5)

（2）方法的精密度试验。将同一批样品平行测定2次，求其相对标准偏差（RSD）。结果显示，所测定的RSD为0.693%，说明此方法的精密度高或重现性好。其试验结果见表7。

表7 青荚叶多糖含量测定重现性试验结果(N=2)

2.8 回收率测定

采用标样加入法,用微量取液器吸取1.0ml稀释液，向其中加入50μl葡萄糖标准溶液,按标准曲线的制备方法测定吸光度，查标准曲线得样品液加标前和加标后中多糖的含量,测定该方法的回收率。采用标样加入法测得平均回收率为100.7%。结果表明，此方法的准确度高。

3 讨 论

多糖的测定方法很多,如蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法、水杨酸法、斐林法。由于苯酚-硫酸法操作简单，价格低廉，因而本实验采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。实验中所作的标准曲线好,通过回收率测定实验可知,本方法所测多糖含量准确率较高，且方法简便、灵敏,在今后应用苯酚-硫酸法测定青荚叶多糖含量时具有一定的参考价值。

在测定青荚叶多糖含量时，保持较高的硫酸浓度非常重要，因为该显色反应是以对多糖的水解和糠醛反应为基础的，硫酸浓度降低，会影响两种反应的进行，由于样品溶液及苯酚的加入量都会影响硫酸的浓度，因而必须控制一个合适的比例。本实验所建立的方法简便、快速、灵敏、准确，测量结果可靠，测定了青荚叶多糖平均含量为274.3μg/g，多糖的含量较为丰富。由于多糖大多具促进免疫、抗病毒、抗肿瘤等活性，青荚叶富含多糖，青荚叶具有广阔的开发应用前景。

[1]娄方明，白志川，杨娟.长叶胡颓子与中华青荚叶化学成分研究[D].重庆:西南大学，2006.

[2]王开发，支崇远，王隆华.我国花粉多糖测定及其意义[J].养蜂科技，2004(3):2-3.

[3]Gabriela Cuesta, Norma Suarez，Maria I Bessio，et al. Quantitative Determination of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Serotype 14 Using a Modification of Phenol-sulfuric acid Method[J]. Microbiological Methods，2003，52(1):69-73.

[4]鲁建江，王莉，顾承志，等.商陆多糖的微波提取及含量测定[J].首都医药，2002(5):55-56.

[5]张双凤，林香娟，于村.苯酚-硫酸法测定胖大海凉茶中多糖的研究[J].河南预防医学，2000，11(3):144-145.

[6]吴拥军，刘洁，吴予明，等.中药巴戟天多糖的测定及其微量元素的分析[J].光谱学与光谱分析，2005，12(25):2077-2078.

[7]高丽君，王汉忠，崔建华，等.苯酚-硫酸法测定白首乌中多糖含量[J].山东农业大学学报:自然科学版，2004，35(2):295-297.

[责任编辑：李 洁]

Extraction and Determination of Helwingia Japonica Polysaccharides

LI Shuangmei
(Petrochemical Engineering and the Environment Engineering Environment, Puyang Vocational and Technical College, Puyang, 457001, China)

To develop Helwingia japonica resources, the phenol - sulfuric acid method is applied to determine the content of polysaccharide and the result is 274.3μg/g. This method is simple, rapid and accurate. Helwingia japonica contains a wealth of polysaccharide, and will have a prosperous future.

Polysaccharide; Phenol- sulfuric acid method; Helwingia japonica

R284.2

A

1671-4326(2010)02-0049-04

2009-12-26

国家自然科学基金（20675073）

李双妹（1971—），女，河南濮阳人，濮阳职业技术学院石油化工与环境工程系讲师，硕士研究生.