高效液相色谱测定人血清格列吡嗪方法的研究

陆 英 江苏省昆山市中医医院门诊药房（215300）

高效液相色谱测定人血清格列吡嗪方法的研究

陆 英 江苏省昆山市中医医院门诊药房（215300）

采用高效液相色谱法（HPLC）测定人血清格列吡嗪药物的浓度，具有灵敏度高，检测速度快的优点。采用这种方法的精密度和回收率都能满足测定人血清格列吡嗪浓度的要求。

高效液相色谱；人血清；格列吡嗪

格列吡嗪(GLi) 是第二代磺酰脲类口服降血糖药，主要作用于胰岛β细胞[1]，通过加强胰岛素的作用，促进内源性胰岛分泌对于非胰岛素依赖型(Ⅱ型) 糖尿病的治疗，是有效且安全的药物[2]。为了研究格列吡嗪的生物利用度及其生物等效性，本研究采用高效液相色谱法(HPLC) 及DAD测定人血清中格列吡嗪的方法。

1 实验器材

1.1 仪器 HP1090M高效液相色谱仪，HP108309输液系统，HP自动进样器，HPDAD (二级管阵列检测器)，HP9153A数据处理仪，HP Think Jet 打印机，HP 彩色作图仪(以上均为美国惠普公司产品)，超级微量恒温器HW—86(上海浦江分析仪器厂)。

1.2 色谱条件 色谱柱Lichrosorb Si60 5u 150mm× 4.6mm，流动相甲醇:水= 50:50，流速1ml/min，DAD 检测波长为275nm，测定灵敏度为0101AUFS，进样量为20µl。

1.3 药品、试剂 格列吡嗪片，5mg/ 片，批号980706-1，山东省莒南制药厂产品，美吡达(格列吡嗪片)，5mg/片，批号990821，海南金晓制药有限公司产品。格列吡嗪标准品，批号9804005 含量98.5 %，上海市医药公司第十五制药厂产品。甲醇，优级纯，北京化工厂产品，双蒸水，本实验室自制。Wash 试剂，色谱纯，美国伯乐公司产品。

2 实验方法

2.1 实验设计 随机选取某地区12名健康志愿者作为研究对象，男性，年龄（23.8±1.）岁（23.8±1.2）y，体重（67.5±5.32）kg，将12名研究对象随机分成两组，作如下实验安排：每组6个人，禁食12h后，对每个研究对象由肘静脉采血4ml，放入肝素化试管中，第一组研究对象用溶有50g蔗糖100ml温水送服10mg格列吡嗪片，第二组研究对象用溶有50g蔗糖100ml温水送服10mg美吡达，两组在服药2h后统一进食标准餐，并于服药后0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0h对每个研究对象由肘静脉采血4ml，放入肝素化试管中，两次采血的样本均3 000r/min 离心15min，分别取各个样本的血浆分装入1.5ml的小离心管内，-20℃的冰箱内保存至测定。

2.2 标准曲线制备 ①格列吡嗪血浆标准溶液的配制：精密称取16.24mg的格列吡嗪片，用流动相将其溶解，并用容量瓶定容至20ml，配成浓度为8mg/ml，母液用流动相稀释成8µg/ml，之后用空白血浆依次稀释，配制成浓度为800，400，200，100，50，25，12.5ng/ml的格列吡嗪血浆标准溶液。②取上述血浆400µl加入100ml浓度为50mg/ml的尼索地平，之后再加入800µlWash试剂，混匀，并以3 000r/min 离心20min，之后吸取上清液800µl，并用超级微量恒温器在37℃下蒸干，用100µl的流动相溶解残渣后进样分析，以标准品浓度/内标浓度为横坐标，以标准品峰面积/内标峰面积为纵坐标，建回归方程，并做标准曲线[3]。

2.3 血浆样品处理 处理研究对象血浆样品所采取的方法要求与处理标准血浆时的方法相同。

2.4 回收率 分别配制20，300，700ng/ml血浆格列吡嗪溶液，均按标准的方法进样5次，记录实际测得的浓度结果，回收率=测得值/加入值。

2.5 精密度试验 分别配制20，300，700mg/ml 格列吡嗪血浆溶液各10份，五份冷冻保存为作日间精密度做准备，另外5份分别进样，同时记录对应的峰面积，计算日内精密度，同样的样品连续进样5d，记录相应的峰面积，计算日间精密度[4]。

2.6 最低检测浓度 按噪比3 :1 计算最低检测浓度。

3 结果与讨论

3.1 按实验设计中的色谱条件，格列吡嗪与内标分离良好，保留时间分别为1.653，2.535min。血浆空白色谱图和服用格列吡嗪后血浆色谱图如图1和图2 所示。

图1 格列吡嗪血清空白色谱图

图1 格列吡嗪血清样品色谱图※保留时间为1.636min的色谱峰为格列吡嗪

3.2 标准曲线 格列吡嗪回归方程为：

Response Ration = 1.45(Amt Ratio)+10.7 r= 0.998

3.3 回收率试验 浓度为20，300，700ng/ml3种格列吡嗪血浆溶液的回收率为（93.2±10.2）%，（91.0±9.4）%和（94.8 ±5.7）%。

3.4 精密度试验 浓度为20，300，700ng/ml三种浓度格列吡嗪血浆溶液日内精密度分别为5.88 %，4.85%，4.65%，日间精密度分别为12.14%，7.60%，5.22%。

按信噪比3:1计算格列吡嗪最低检测浓度为15ng/ml[5]。

综上所述，本文所用方法简便且快速准确，可应用于药物的代谢动力学和生物等效性研究中。

[1] 张洪德,朱熊,周炳生,等.国产与进口格列吡嗪治疗非胰岛素依赖型糖尿病比较[J]. 新药与临床,1993 ,12(3):138.

[2] 叶发青,邢翔飞,肖若蕾,等.高效液相色谱法测定血浆中格列吡嗪的浓度 [J].医学导报,2002,21(7):440-441.

[3] 傅善基,刘向群,张健,等.人血清格列吡嗪高效液相色谱测定方法的研究[J].山东生物医学工程,2002,21(3):31-3.

[4] 李琼,李新中,徐平声. HPLC 法测定血浆中格列吡嗪浓度[J].医学临床研究,2005,22(1):137-138.

10.3969/j.issn.1672-2779.2010.23.164

1672-2779（2010）-23-0199-02

2010-09-25）