辐照鸡肉邻位酪氨酸含量检测方法的研究

林 琳，张 可，钱 和

(1.上海市质量监督检验技术研究院，上海 200233；2.空军航空医学研究所，北京 100000；3.江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122)

辐照鸡肉邻位酪氨酸含量检测方法的研究

林 琳1，张 可2，钱 和3,*

(1.上海市质量监督检验技术研究院，上海 200233；2.空军航空医学研究所，北京 100000；3.江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122)

建立辐照鸡肉中邻位酪氨酸含量的高效液相色谱检测方法。辐照鸡肉中的邻位酪氨酸经105℃，6mmol/L盐酸溶液水解4h以上，C18固相萃取柱净化，5%乙腈溶液分3次洗脱目标物，在激发波长275nm，发射波长305nm，98% 0.2mol/L NaH2PO4水溶液和2%乙腈作为流动相的条件下，用荧光检测器进行检测。研究表明，检出限为0.1mg/kg，加标水平在1.0mg/kg时，回收率为97.3%。辐照剂量在10～100kGy的范围内，辐照鸡肉中邻位酪氨酸含量与辐照剂量呈线性关系。

邻位酪氨酸；高效液相色谱法；辐照鸡肉

Abstract ：A method using HPLC with fluorescence detection was developed for the determination of o-tyrosine in irradiated chicken products. Samples were hydrolyzed with 6 mmol/L HCl at 105 ℃ for 4 h in a vacuum environment and cleaned up on a C18solid-phase extraction column. Three-time elution of the column with 5% actonitrile in water was carried out for the desorption of o-tyrosine. The excitation and emission wavelengths for fluorescence detection were set at 275 nm and 305 nm, respectively.The method exhibited a limit of detection of 0.1 mg/kg. The average spike recovery (6 replicates) for o-tyrosine at 1.0 mg/kg was 97.3%. Over the range of 10 to 100 kGy, irradiation dose displayed good linearity with o-tyrosine content of irritated chicken meat.

Key words：o-tyrosine；HPLC method；irritated chicken meat

辐照食品的定义是指利用放射性60Co 或137Cs 发出的γ射线或利用电子加速器产生的电子束(最大能量10MeV) 或X射线(最大能量5MeV) 在一定的剂量范围内处理而达到灭菌保鲜的食品。通过辐照工艺处理的食品营养损失小，不改变食品原有色香味形，卫生安全，保鲜期较长，既可避免药物保鲜带来的物质残留，又可以杀灭食品中的害虫，消除食品中病原微生物及其他腐败细菌，抑制食品(如水果、蔬菜等活机体) 的生理生化过程(发芽和成熟)，从而达到食品保藏或保鲜的目的[1]。

在辐照食品检测方面，欧盟现已颁布碳氢化合物的气相色谱(GC) 分析法、2-烷基环丁酮的GC/MS 分析法、骨骼及纤维素的电子自旋共振( ESR) 谱法和硅酸盐矿物的热释光法、结晶糖的ESR 谱法、光致发光法、直接表面荧光过滤技术/富氧板计数的微生物筛选法[2]、DNA彗星筛选法等辐照食品检测的多种标准方法[3-4]。但由于辐照食品种类的复杂性和技术的局限性，没有一种技术有可能用于所有食品物料，如含脂食品的碳水化合物需要采用2-烷基环丁酮法检测，含骨食品需要采用电子自旋共振法检测，含硅矿物质食品或农产品需要采用热辉光检测。我国有关辐照食品的法规、标准不足，尚未完善，已经制订的标准、法规、规程等也未与国际接轨，各国对食品辐照问题仍存在许多技术和认识上的差异，尤其是缺乏系统可行的辐照食品检测方法，严重影响了辐照食品的国际贸易。

本实验利用高效液相色谱检测法(HPLC)，通过检测辐照后肉制品中邻位酪氨酸含量的变化来判别肉制品是否经过辐照。邻位酪氨酸即DL-o-tyrosine，是L-酪氨酸的同分异构体，它与L-酪氨酸在结构上的差异主要在苯环上的羟基，即L-型酪氨酸在对位p-，而邻位酪氨酸在邻位o-上。应用辐解产物检测辐照蛋白质食品已经进行了许多研究，其中苯丙氨酸或含苯丙氨酸的蛋白质食品辐照产生的羟基化产物——邻位酪氨酸和间位酪氨酸更富应用潜力。因此在食品中这些产物的存在可被看作是食品已被辐照的标志。辐照生成的酪氨酸异构体中，邻酪氨酸的量最大，利用色谱技术可将其与天然的对酪氨酸分离，因此选用邻酪氨酸作为检测蛋白质食品辐照的探针化合物[5-8]。大多数氨基酸在紫外可见光区无吸收，必须将其衍生、转化为具有紫外可见吸收或能产生荧光的物质才能检测，但是酪氨酸例外。大多数情况下，由于吸收辐射能而被提升到激发电子态的分子都是通过激发能的非辐射转移给周围的分子回复到基态，能量以热的形式散失，但也有分子将再辐射，从而产生荧光[9-11]。酪氨酸残基是蛋白质中最主要的内源荧光基团之一，其结构上的酚羟基是强的给电子基团，是能够加强荧光量子产生的基团，通常不需要衍生基团的协助即可产生荧光，而邻位酪氨酸由于酚羟基从对位转移到邻位，此时邻位取代基的空间效应大于间位和对位取代基的重原子效应和吸电子诱导效应，起着主导作用，不仅加强了邻位酪氨酸的荧光量子产生率而且使化合物的荧光寿命比酪氨酸更长。因此本实验尝试建立非衍生的样品处理方法来检测鸡肉中的邻位酪氨酸含量。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

鸡肉 上海出入境检验检疫局。

邻位酪氨酸(标准品)、甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、磷酸二氢钠(色谱纯)、盐酸(分析纯)。

Agilent 1100液相色谱仪 美国Agilent公司；T25basic ULTRA-TURRAX高速捣碎机；LABOROTA4003 旋转蒸发仪 德国Heidolph公司；固相萃取系统 美国Supelco 公司。

1.2 样品的处理

将辐照和未经辐照的鸡肉样品去皮、去骨，并小心去除黏附在肌肉上的脂肪，取鸡腿部分，在组织搅碎机中搅碎均匀，称取0.2～0.5g(精确到0.001g)样品于试管中，加入6mmol/L盐酸5.0mL，抽真空后密封105℃水解4h。水解液经滤纸粗过滤后取1mL经C18固相萃取柱净化，C18固相萃取柱预先用甲醇和水活化，用5%乙腈溶液分3次洗脱目标物，并定容至5.0mL。以下实验均以冷冻鸡肉为代表。

1.3 邻位酪氨酸标准品的配制

称取0.01g(精确到0.0001g)标准品于100mL容量瓶中，用流动相定容(流动相组成详见仪器条件)，此溶液邻位酪氨酸含量为100mg/L，作为标准储备液。再将标准储备液稀释100倍后作为标准工作液，标准工作液中邻位酪氨酸的含量为1.0mg/L，工作液需现用现配。

1.4 仪器条件

色谱柱：C18反相色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；检测器：荧光检测器，激发波长275nm，发射波长305nm；流动相：98% 0.2mol/L NaH2PO4溶液和2%乙腈；流速：1.0mL/min；进样量：20μL。

2 结果与分析

2.1 检出限

2.1.1 基线噪音

在所需的仪器条件下，仪器平衡1h后，测得仪器的噪音为h噪音=0.023mAU。

2.1.2 检出限

当响应信号应为噪音的3倍时所需的样品量即为最低检出限。质量浓度为0.1μg/mL标样在相同条件下进样6次，按检出限的定义分析数据可得本方法对邻位酪氨酸的检出限为0.1mg/kg。

2.2 样品水解条件的优化

2.2.1 最适水解时间

表1 105℃不同水解时间对回收率的影响Table 1 Effect of length of acidic hydrolysis on o-tyrosine recovery in irritated and unirritated chicken meat

辐照鸡肉样品的水解温度通常为105℃。实验中发现，在此条件下水解1h，辐照鸡肉样品未检出邻位酪氨酸，而由表1可知，水解4h或以上均可以达到消化完全，且目标物无明显损失，因此105℃下的最适水解时间为4h。

2.2.2 水解液净化浓缩条件

2.2.2.1 水解液未浓缩

图1 未经浓缩的样品谱图Fig.1 Chromatogram of the unconcentrated sample hydrolysate

将水解液经滤纸粗过滤后取1mL经C18固相萃取柱净化，C18固相萃取柱预先用甲醇和水活化。用5%乙腈溶液分3次洗脱目标物，并定容至5mL后直接进样。结果回收率可达85%以上，但是阳性样品目标物响应面积较小(图 1)。

2.2.2.2 水解液经固相萃取柱净化后浓缩

图2 浓缩后样品谱图Fig.2 Chromatogram of the concentrated sample hydrolysate

将水解液经滤纸粗过滤后取1mL经C18固相萃取柱净化，用5%乙腈的水溶液分3次洗脱目标物，合并洗脱液并用氮气吹干至1mL后进样。回收率同样可达85%以上，但阳性样品目标物响应面积明显增加(图2)。说明实验中采用浓缩步骤更易于检测以及目标物的分离。

2.3 固相萃取柱条件

2.3.1 固相萃取柱种类的选择

表2 不同固相萃取柱的选择Table 2 Recovery of o-tyrosine in irritated and unirritated chicken meat extracted with different solid-phase extraction columns

实验过程中，使用的未辐照鸡肉中邻位酪氨酸含量小于0.1mg/kg，辐照剂量为10kGy的鸡肉中邻位酪氨酸含量即鸡肉样品的本底值为1.67mg/kg，加标量为20mg/kg。由表2可知，采用C18固相萃取柱进行萃取净化较适宜。

2.3.2 洗脱体积的确定

称取0.5g未辐照鸡肉(精确到0.001g)样品于试管中，并加入标样10μg，按1.2节的方法处理，取1mL过C18柱，测定不同洗脱体积下的回收率，如表3所示。

表3 不同洗脱体积对回收率的影响Table 3 Effect of amount of the elution solvent on o-tyrosinerecovery

由表3可知，当洗脱体积达到5mL时，加标回收率为89.3%，说明目标物收集基本完全，故本实验中采用的洗脱体积为5mL。

2.4 盐酸浓度对酪氨酸含量的影响

称取辐照后的鸡肉样品0.2g左右(精确到0.001g)，在采用不同浓度盐酸水解的条件下分别进行回收率实验，比较用不同浓度的盐酸进行水解对辐照鸡肉中邻位酪氨酸含量的影响。其中各辐照鸡肉样品中加入质量浓度为0.1μg/μL的标样5μL，即加标量为0.5μg，样品定容体积为5.0mL。按1.2节方法操作，结果见表4。由表4可知，当盐酸浓度为6.0mmol/L时，样品检出值较高，加标回收率也最好。

表4 盐酸浓度对回收率的影响Table 4 Effect of HCl concentration on o-tyrosine recovery

2.5 加标回收率

移取适量标准溶液加入到样品中，使加标量控制在1.0mg/kg样品。充分混合均匀后，经提取后定容到1.0mL；再经0.45μm有机膜过滤后直接注入液相色谱仪，记录色谱图。实验结果总结于表5。

表5 方法回收率Table 5 Average spike recovery (6 replicates) for o-tyrosine at 1.0 mg/kg

2.6 邻位酪氨酸含量与辐照剂量的关系

表6 鸡肉中辐照剂量和邻位酪氨酸含量的关系Table 6 Relationship between irradiation dose and o-tyrosine content of irritated chicken meat

由表6可知，当辐照剂量在10～100kGy的范围内，辐照剂量与邻位酪氨酸的含量呈线性关系，因而可以依据邻位酪氨酸的含量来间接推测鸡肉被辐照的剂量。

3 结 论

辐照鸡肉中的邻位酪氨酸在105℃，6mmol/L盐酸水解4h以上，C18固相萃取柱净化5%乙腈溶液分3次洗脱目标物，经高效液相色谱荧光检测器检测的方法，可以满足实验要求，且在10～100kGy辐照剂量内辐照剂量与邻位酪氨酸的含量呈线性关系。

[1] CRAWFORD L M, RUFF E H. A review of the safety of cold pasteurization through irradiation[J]. Food Control, 1996, 7(2): 87-97.

[2] HENRY D. Rapid and simple screening tests to detect the radiation treatment of foods[J]. Radia Phys Chem, 1995, 46(4/6): 677-680.

[3] DELINCEE H. Control of irradiated food: Recent developments in analytical detection methods[J]. Radia Phys Chem, 1993a, 42(2/6): 351-357.

[4] HITCHEOCK C H S. Determination of hydrogen using a novel hydrogen-specific electronic sensor: A potential method for detecting irradiated food[J]. J Sci Food Agric, 1993, 62: 301-305.

[5] PENTIMALLI M, CAPITANI D, FERRANDO A, et al. Gamma irradiation of food packaging materials: all NMR study[J]. Polymer, 2000,41: 2871-2881.

[6] MAKOTO M, HITOSHI I, AKIKO S, et a1. Detection of irradiation of meats by HPLC determination for o-Tyrosine using novel laser fluorometric detection with automatic pre-column reaction[J]. Journal of Health Science, 2000, 46(4): 304-309.

[7] DONG E M, HASHISAKA A E, RASCN B A, et a1. Irradiated or aseptically prepared frozen dairy desserts: acceptability to bone marrow transplant recipients[J]. Journal of the American Dietetic Association,1992, 92(6): 719-723.

[8] MALONE J W. Consumer willingness to purchase and to pay more for potential benefits of irradiated fresh food products[J]. Agribusiness, 1990,6(2): 163-178.

[9] STEELE J H, ENGEL R E. Radiation processing of food[J]. Journal of the American Veterinary Medical Association, 1992, 201(10): 1522-1529.

[10] HEIN W G, SIMAT T G, STEINHART H. Detection of non-protein bound o-tyrosine as a marker for the detection of irradiated shrimps[J].Eur Food Res Technol, 2000, 210: 299-304.

[11] LEE P R. Irradiation to prevent-foodborne illness[J]. Journal of the American Medical Association, 1994, 272(4): 261.

HPLC Determination of o-Tyrosine in Irradiated Chicken Products

LIN Lin1，ZHANG Ke2，QIAN He3,*
(1. Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research, Shanghai 200233, China；2. Airman Aeromedicine Institution,Beijing 100000, China；3. State Key Laborary of Food Science and Technology, Jiangnan University , Wuxi 214122, China)

TS207

A

1002-6630(2010)10-0188-04

2009-05-21

“十一五”国家科技支撑计划项目(2008BAD91B04-1)；教育部创新团队基金项目(PCSIRT0627)；

教育部创新引智计划项目(111-project-B07029)

林琳(1978—)，女，工程师，硕士，研究方向为食品安全与质量控制。E-mail：linliniris@hotmail.com

*通信作者：钱和(1962—)，女，教授，博士，研究方向为食品安全与质量控制。E-mail：amtf168@126.com