刺五加多糖的提取工艺及抗氧化活性研究

孟繁磊，陈瑞战*，张 敏，陈瑞平

(长春师范学院化学学院，吉林 长春 130032)

刺五加多糖的提取工艺及抗氧化活性研究

孟繁磊，陈瑞战*，张 敏，陈瑞平

(长春师范学院化学学院，吉林 长春 130032)

目的：研究刺五加多糖(Acanthopanacis senticosi polysaccharides，ASP)的超声提取工艺及不同产地、不同采集时间的刺五加多糖含量及抗氧化活性，确定刺五加的最佳采收地点和时间。方法：采用正交试验优化超声提取工艺参数、苯酚-硫酸法测定多糖含量；分别用FRAP法、邻苯三酚自氧化及DPPH法测定刺五加多糖抗氧化活性。结果：超声提取的最佳工艺条件为：提取温度70℃、提取时间90min、超声功率500W、提取次数3次；不同采集地点的刺五加多糖含量明显不同，其中二参厂产刺五加多糖含量＞大湖产刺五加多糖含量＞兴隆产刺五加多糖含量；而同一采集地点，随着采收时间的推迟，多糖含量在6～8月呈增加趋势，9月份以后多糖含量开始下降。抗氧化活性测定结果表明，12批不同来源的刺五加提取的多糖都具有较好的抗氧化活性，3种方法测定结果表明二参厂8月份采集的刺五多糖抗氧化活性最强。结论：优选得到的刺五加超声提取工艺稳定可行；8月份采自二参厂的刺五加多糖含量和抗氧化活性最高。

刺五加；多糖；提取工艺；抗氧化活性

Abstract：The optimal procedure for the ultrasonic-assisted solvent extraction of Acanthopanacis senticosi polysaccharides(ASP) was investigated using orthogonal array design. The effects of different geographic origins and different harvesting times on polysaccharide content and antioxidant activity of crude ASPs from the leaves of Acanthopanacis senticosi were addressed.The phenol-sulfuric acid method was used for polysaccharide determination and the antioxidant activity of the ASP extract was tested by FRAP assay, pyrogallol autoxidation method and DPPH radical scavenging assay. The optimum conditions for the ultrasonic-assisted solvent extraction of ASP were found to be: extraction temperature 70 ℃ and ultrasonic power 500 W for 3-time extraction for 90 min each time. The polysaccharide contents of crude ASPs from different geographic origins were obviously different and decreased in the following order: Ershenchang ＞ Dahu ＞ Xinglong. With the harvesting time prolonged from June to August, crude ASPs from the same geographic origin exhibited an increasing trend in polysaccharide content;beyond September, an opposite pattern was observed. Antioxidant activity testing revealed that a total of 12 samples of crude ASPs from 3 geographic origins harvested during June-September, respectively were all strong antioxidants. The strongest antioxidant was the ASP extract from Ershenchang harvested in August.

Key words：Acanthopanacis senticosi；polysaccharides；extraction；antioxidant activity

多糖是指由10个或10个以上单糖聚合而成的一类生物大分子。研究发现多糖不仅具有抗癌、抗炎、抗病毒、抗衰老等多方面药理活性[1]，而且对物理的、化学的及生物来源的多种活性氧簇(ROS)具有良好的清除作用，能抑制UV所导致的脂质过氧化、减少脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的生成，抑制体外H2O2诱导的红细胞溶血[2-4]，增加超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH2Px)活性等[5]，使多糖具有较好的抗氧化活性，而抗氧化作用是一些多糖抗衰老、抑肿瘤、降血脂、降血糖的作用机制之一[6]，近年来国内外已将抗氧化检测用于抗衰老等保健食品的评价[7-8]。加之多糖本身低毒、来源广泛，已成为近年来的研究热点。

刺五加(Acanthopanax senticocus(Rupr. et Maxim.)Harms)系五加科植物，主要分布在我国黑龙江、吉林、辽宁、河北等，是我国东北地区典型的药用植物。中医和本草纲目认为，刺五加是补气药，能益气健脾、补肾安神[9]，广泛应用于治疗心脏病、高血压、风湿病、糖尿病等多种疾病[10-12]。刺五加中的有效成分包括刺五加多糖、刺五加总皂苷、异秦皮啶、β-谷甾醇、胡萝卜苷、紫丁香树脂醇苷等。研究表明，刺五加多糖具有较强的抗肿瘤作用，尤其是对小鼠S180肉瘤和人白血病粒细胞K562作用显著[13]。刺五加多糖是理想的免疫增强剂，它可以促进T细胞、B细胞、NK细胞等细胞因子的产生[14]，刺五加多糖还具有较强的抗氧化活性[15]。

本实验以不同产地、不同采集时间的刺五加叶为原料，采用正交试验来确定刺五加多糖超声提取的最佳工艺，并对其多糖含量和总抗氧化活性及清除O2·和有机自由基DPPH进行系统研究，以期为刺五加多糖药物及功能性食品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

12批刺五加叶为不同产地或相同产地不同采收期的样品(表 3)。

1,1-二苯基-2-苦基肼基(DPPH，纯度90%)、三吡啶三吖嗪(TPTZ，纯度98%)、抗坏血酸(VC) Sigma-Aidrich公司；苯酚、硫酸、邻苯三酚、葡萄糖、无水乙醇、无水醋酸钠、三氯化铁等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-2401型紫外可见分光光度计 日本岛津公司；GENIOS酶标仪 Tecan奥地利公司；ALPHA 2-4冷冻干燥机 德国Marin Chris公司；EYEL4型旋转蒸发器 东京理化器械株式会社；KQ-500DE医用数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；TDL-40B离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

将刺五加叶洗净、烘干至质量恒定，高速中药粉碎机中粉碎，乙醚浸泡24h，挥干乙醚，残渣加95%的乙醇回流3h，残渣挥干溶剂，装入自封袋备用。

1.3.2 刺五加多糖的提取工艺流程

1.3.2.1 刺五加多糖提取的单因素试验

在其他条件相同的条件下，分别研究提取温度(40、50、60、70、80℃)、提取时间(30、60、90、120、150min)、超声功率(100、200、300、400、500W)、提取次数(1、2、3、4、5)4个单因素对刺五加多糖提取率的影响。

1.3.2.2 刺五加多糖提取的正交试验

在单因素试验的基础上，以粗多糖提取率为筛选指标，对影响刺五加多糖超声提取的主要因素进行正交试验L9(34)，确定超声提取刺五加多糖的最佳提取工艺参数。

1.3.3 刺五加多糖的含量测定

参照2005版《中国药典》，采用苯酚-硫酸法测定。

1.3.3.1 标准曲线的绘制

精确称取105℃干燥后的葡萄糖103.8mg，加蒸馏水溶解，定容至100mL。得质量浓度为1.038mg/mL的葡萄糖标准溶液。分别精确量取0、1.00、3.00、5.00、7.00、9.00、11.00mL的葡萄糖标准液，置于100mL的容量瓶，加水定容至100mL，摇匀。精确量取上述各溶液2mL，加入1mL 5%苯酚试液，再加入5mL浓硫酸，室温静置10min，于40℃恒温水浴15min，取出，迅速冷却至室温。于波长490nm处测吸光度。以吸光度A为纵坐标，质量浓度c(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.3.2 粗多糖含量测定

分别称取12批不同来源的刺五加提取得到的多糖(命名为ASP1～ASP12)各10mg，配成0.1mg/mL的供试液，按标准曲线制备方法测定吸光度。

式中：c为测得的样品溶液的葡萄糖质量浓度/(mg/mL)；V为供试液体积/mL，本实验取100mL；m为供试品的质量/mg；Y为多糖提取率/%；m为醇沉后得到的多糖质量/g；m1为称取的刺五加的质量/g。

1.3.4 刺五加多糖抗氧化活性的测定

1.3.4.1 铁还原/抗氧化能力(ferric reducing/antioxidant power，FRAP)法测定刺五加多糖总抗氧化活性

将醋酸钠缓冲液(300mmol/L，pH3.6)、10mmol/L TPTZ(溶解在 40mmol/L HCl中)和 20mmol/L FeCl3溶液以10:1:1(V/V)的比例混合，配制成FRAP试剂(临用前新鲜配制)。将VC标准品配成浓度为0.5mmol/L，样品配成一定浓度(使样品的吸光度与VC的吸光度相当)。取5μL VC标准品或样品溶液加入96孔酶标板中，之后迅速加入FRAP试剂150μL。测定0min和4min标准品和样品的吸光度，每个标准品和样品平行测定6个。结果以500μmol/L的VC为标准来计算。

式中：ΔA＝A4min－A0min。

1.3.4.2 刺五加多糖对O2·的抑制作用[16]

试管中加入5mL 50mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH8.20)和4.7mL蒸馏水，各管分别加入0.1mL不同浓度的刺五加多糖溶液，混匀后在25℃水浴20min，取出后立即加入3.0mmol/L邻苯三酚0.20mL(25℃水浴，以10mmol/L HCl配制)，迅速摇匀后倒入比色杯。邻苯三酚自氧化时以0.1mL蒸馏水代替多糖溶液。以10mmol/L HCl溶液作为参比，325nm波长处每隔30s测定吸光度。多糖对O2·的抑制作用以抑制率表示。

式中：ΔA0为邻苯三酚自氧化速率；ΔA为加入刺五加多糖溶液后邻苯三酚自氧化速率。

1.3.4.3 刺五加多糖对有机自由基DPPH的清除作用

取不同浓度的粗多糖待测样品溶液0.5mL，加入2.5mL 6.5×10-5mol/L DPPH溶液，立即混匀，静置0.5h后，于517nm波长处测定吸光度Ai。则多糖对DPPH·的清除率可表示为：

式中：Ai为DPPH与样液反应后的吸光度；Aj为样品空白(样品0.5mL+2.5mL 95%乙醇)的吸光度；Ac为未加样的DPPH溶液(2.5mL DPPH+0.5mL 95%乙醇)的吸光度；每一样品平行测3次，取其平均值。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以葡萄糖为标准，苯酚-硫酸法测定刺五加多糖含量的回归曲线方程为A＝9.8414C－0.0488，相关系数R2=0.9998，线性范围10～130μg/mL。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取温度的影响

图1 提取温度对多糖提取率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on ASP yield

由图1可知，在40～60℃的温度范围内，随着温度的升高，反应物的能量增加，多糖溶出率增加，提取率随温度的升高而增加，在60℃时提取率达到峰值。在60℃后，多糖提取率随温度的增加而降低，有可能是因为温度高，在超声的空化作用和高温的双重作用下使得多糖降解，从而使提取率降低。所以，超声提取刺五加多糖的提取温度选择60℃较为适宜。

2.2.2 提取时间的影响

图2 提取时间对多糖提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on ASP yield

由图2可知，在 30～150min，多糖提取率随超声时间的增加而增加，这是由于超声波提取多糖的过程是原料中多糖成分不断溶出并向提取液中扩散的过程。刚开始时提取溶剂中多糖含量较低，而原料组织中多糖的含量为最大值，则多糖的浓度梯度最大，多糖成分由固体原料内部向周围提取溶剂扩散的传质动力较大，因此随时间的增加多糖提取得率快速增加。随着提取时间的增加，提取溶剂中多糖的含量逐渐增大，而同时原料组织中，多糖含量逐渐降低，则多糖物质的浓度梯度不断减少，至趋近于组织细胞内外多糖浓度平衡，所以在90～150min，多糖提取率增加较缓慢，综合考虑，超声法提取刺五加多糖提取时间选择90min较为适宜。

2.2.3 超声功率的影响

图3 超声功率对多糖提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on ASP yield

从图3可以看出，在100～400W的功率范围内，随着超声功率的增加，刺五加多糖提取率快速增加，在400W时出现峰值，超声波功率超过400W刺五加多糖提取得率随功率增加而逐渐降低。主要原因可能是较高的超声功率下，超声空化作用强，可加速组织细胞的破碎，促进多糖提取率的快速增加。但当超声功率过大(超过400W)，导致空气气泡没有足够的时间溃陷时，超声空化作用反而降低，同时在较大超声功率作用下多糖可能发生降解等结构变化，导致提取得率下降。因此刺五加多糖提取超声功率选择400W较为适宜。

2.2.4 提取次数的影响

图4 提取次数对多糖提取率的影响Fig.4 Effect of extraction frequency on ASP yield

由图4可知，多糖提取率随着提取次数的增加而增加，原因可能是当水进入到刺五加组织细胞时，由于扩散渗透作用水逐渐通过细胞壁透入到细胞内，溶解了可溶性多糖，而造成细胞内外的浓度差，于是细胞内的多糖不断向外扩散，水又不断进入刺五加组织细胞内，如此多次往返，直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡，将此饱和溶液滤出。连续多次加入新溶剂，就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部分溶出。所以随着提取次数的增加多糖的提取率逐渐增大，但从图4可以看出当提取次数达到3次时，再增加提取次数，多糖提取率增大的幅度不大，而且消耗时间也会延长，工作量加大，从经济等多方面综合考虑，选择最佳提取次数为3次。

2.3 正交试验结果

在单因素试验的基础上，选择对刺五加多糖提取得率影响较大的提取温度、提取时间、超声功率、提取次数为因素，在各因素最佳值附近分别取3个水平(表1)，以多糖提取得率为指标，做四因素三水平正交试验，依据L9(34)正交试验表优化多糖提取的最佳工艺。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

表2 刺五加多糖提取正交试验设计方案及结果Table 2 Orthogonal array design matrix and corresponding experimental results of ASP yield

由表2直观分析表明，用超声法提取刺五加多糖选择水为溶剂，以多糖提取率为评价指标，最优提取工艺为A3B2C3D2，即提取温度70℃、提取时间90min、超声功率500W、提取次数3次。刺五加多糖的最高提取率为10.04%。各因素对提取率的影响程度依次是超声功率＞提取温度＞提取次数＞提取时间。在此最优条件下，取同一批次样品，进行3次验证性实验，计算超声法提取刺五加多糖的平均提取率为10.87%，RSD为0.68%。结果表明优化得到提取工艺稳定可靠。

2.4 不同产地、采集时间的刺五加多糖提取及含量测定结果

不同产地、不同采集时间的12批刺五加多糖提取工艺流程：

表3 刺五加多糖含量测定结果(±s)Table 3 Comparison of polysaccharide content among crude ASPs from the leaves of Acanthopanacis senticosi from different geographic origins harvested different harvesting times (±s)

表3 刺五加多糖含量测定结果(±s)Table 3 Comparison of polysaccharide content among crude ASPs from the leaves of Acanthopanacis senticosi from different geographic origins harvested different harvesting times (±s)

样品来源 样品名称 多糖含量/% 样品来源 样品名称 多糖含量/%兴隆(6月) ASP1 49.45±0.0100 二参厂(8月)ASP7 66.17±0.0044兴隆(7月) ASP2 54.52±0.0133 二参厂(9月)ASP8 60.42±0.0066兴隆(8月) ASP3 58.00±0.0088 大湖(6月) ASP9 50.55±0.0055兴隆(9月) ASP4 56.44±0.0077 大湖(7月)ASP10 55.74±0.0122二参厂(6月) ASP5 55.06±0.0100 大湖(8月)ASP11 60.17±0.0077二参厂(7月) ASP6 59.95±0.0144 大湖(9月)ASP12 57.34±0.0033

由表3可以看出，不同采集地刺五加多糖的含量是二参厂＞大湖＞兴隆，原因可能是地理位置不同，温度、湿度、土壤条件、光照时间等都不同，导致了不同地点刺五加多糖含量的差别；在同一地点采集的刺五加，6～8月多糖含量呈增长趋势，9月份多糖含量有所下降。原因可能是植物的糖分积累，一般在生长发育的早期，主要是淀粉等多糖物质积累。随着植物的成熟进程，多糖类物质会慢慢转化为单糖或双糖物质，当多糖物质转化得差不多时，单糖或双糖积累到一定程度，这时就进入植物生长的成熟阶段。当植物中糖类物质再往下转化时，当多糖完全转化为单糖，单糖又逐渐分解，植物就达到十成熟了。6～8月是刺五加生长发育时期，所以多糖含量呈增加趋势，到了9月份以后，刺五加已经进入成熟时期，是多糖转化为单糖，单糖又逐渐分解的过程。所以，9月份以后，刺五加多糖的含量又开始下降。由此可以初步判断8月份是刺五加的最佳采收时间。

2.5 刺五加多糖总抗氧化活性

图5 刺五加多糖的总抗氧化能力测定结果Fig.5 Comparison of total antioxidant capacity of among crude ASPs from different geographic origins harvested different harvesting times

在低pH值的溶液中，Fe3+-TPTZ (Fe3+-吡啶三吖嗪)可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现出蓝色，并于593nm波长处有最大光吸收，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强弱。采用铁还原/抗氧化能力(FRAP)分析法评估不同产地、不同采集时间刺五加多糖总抗氧化活性结果见图5。

由图5可以看出，不同产地、不同采集时间的刺五加多糖参照VC来看，都具有一定的铁还原/抗氧化能力。其中，二参厂产刺五加多糖抗氧化能力最强，其次是兴隆和大湖产刺五加多糖。对于同一采收地点的铁还原/抗氧化能力也是随着采收时间的推迟，6～8月呈增长趋势，9月份有所下降。FRAP法测定12批刺五加多糖总抗氧化能力之所以是这样的结果，主要与其含量等因素有关。因为它反映的不是样品针对某一种自由基的清除活性，而是样品总还原能力，反映样品总抗氧化活性。FRAP法测定12批刺五加多糖总抗氧化能力进一步确定了刺五加的最佳采收时间和地点：8月份采自二参厂。

2.6 对O·的抑制作用

邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化释放O2·，并生成有色中间产物，该有色中间产物在325nm波长处有一特征吸收峰，当有抑制剂存在时，可清除O2·，从而阻止中间产物的积累，所以，可通过比色法来检测有色中间产物的含量，以检测物质清除O2·的能力。

本实验利用这一特点，测定不同时间反应体系的吸光度，测得邻苯三酚自氧化速率和加入刺五加多糖后邻苯三酚自氧化速率，间接测刺五加多糖对O2·的抑制率，结果见图6～9。

图6 兴隆不同采收期刺五加多糖对O2·的抑制作用Fig.6 Comparison of superoxide anion free radical scavenging activity among crude ASPs from Xinglong harvested at different times

由图6～9可以看出，12批不同来源刺五加多糖，对邻苯三酚自氧化法反应产生的超氧阴离子自由基均具有一定的抑制能力，且多糖质量浓度和对O2·抑制能力具有一定的量效关系：随着多糖浓度的增大对超O2·抑制能力也逐渐增强。其中，对于同一地点采集的刺五加多糖而言，其抑制O2·能力，也是随着采收时间的推迟，6～8月呈增长趋势，9月份有所下降；而对于不同产地采集的刺五加提取多糖，二参厂采收的刺五加提取的多糖抑制O2·能力最强，其次是大湖和兴隆产刺五加多糖；这主要是，不同时间地点采收的刺五加多糖含量不同，导致了其对O2·的抑制作用不同。此结果，也表明刺五加最佳的采收时间地点分别是8月份采自二参厂。

图7 二参厂不同来收期刺五加多糖对O2·的抑制作用Fig.7 Comparison of superoxide anion free radical scavenging activity among crude ASPs from Ershenchang harvested at different times

图8 大湖不同采收期刺五加多糖对O2·的抑制作用Fig.8 Comparison of superoxide anion free radical scavenging activity among crude ASPs from Dahu harvested at different times

图9 不同地点8月份采集刺五加多糖对O2·的抑制作用Fig.9 Comparison of superoxide anion free radical scavenging activity among crude ASPs from different geographic origins harvested in August

2.7 对有机自由基DPPH的清除作用

DPPH自由基是一种稳定的有机自由基，其溶液具有特征的紫红色吸收峰，当存在自由基清除剂时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其所接受的单电子数成定量关系，因而可用分光光度法进行定量分析。

反应体系中清除自由基DPPH的相对百分率，以VC为标准抗氧化剂与样品进行比较，作出清除率随浓度变化的曲线(以浓度为横坐标，清除自由基DPPH的百分率为纵坐标)，计算出对自由基清除率达50%的清除剂用量来评价其清除自由基DPPH的能力(即半抑制浓度，IC50)，结果见图10。

图10 刺五加多糖对有机自由基DPPH的清除作用结果Fig.10 Comparison of DPPH free radical scavenging activity among crude ASPs from different geographic origins harvested at different times

刺五加多糖对有机自由基DPPH的清除作用，结果以IC50表示，IC50的值越小，说明刺五加多糖的抗氧化活性越强。由图10可以看出，12批不同来源的刺五加多糖对有机自由基DPPH都有一定的清除作用，其中，ASP7的清除有机自由基DPPH的能力强于VC(IC50为0.1400mg/mL)，其IC50为0.1245mg/mL。这12批不同来源的刺五加多糖对有机自由基DPPH的清除作用结果，和多糖含量测定结果趋势相同，这说明主要起清除有机自由基DPPH的活性物质是刺五加多糖，其含量的多少，直接影响了对自由基DPPH的清除结果。此结果也表明8月份在二参厂采集刺五加是其最佳的采收时间和地点。

3 结 论

本实验研究了刺五加多糖的超声提取工艺，通过正交试验得到了最优提取工艺参数：提取温度为70℃，提取时间为90min，超声功率为500W，提取次数为3次。不同来源的刺五加提取的多糖含量测定结果表明，不同采集地点的刺五加多糖含量：二参厂＞大湖＞兴隆，而同一采集地点，随着采收时间的推迟，多糖含量在6～8月呈增加趋势，9月份以后多糖含量开始下降；抗氧化活性测定结果表明，12批不同来源的刺五加提取的多糖都具有一定的抗氧化活性，其中ASP7显示出较好的效果，FRAP值为781.82μmol/L，明显优于VC的500 μmol/L，O2·的抑制作用为45.47%，对有机自由基DPPH的清除作用的IC50为0.1245mg/mL，优于对照品VC，所以，刺五加最佳的采收时间和地点为8月份采自二参厂。结果为刺五加综合质量评价方法奠定了基础。

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Extraction and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Acanthopanacis senticosi Leaves

MENG Fan-lei，CHEN Rui-zhan*，ZHANG Min，CHEN Rui-ping
(College of Chemistry, Changchun Normal University, Changchun 130032, China)

S566.9

A

1002-6630(2010)10-0168-07

2009-08-19

孟繁磊(1984—)，女，硕士研究生，主要从事天然产物分析研究。E-mail：mengfanlei622@163.com

*通信作者：陈瑞战(1967—)，男，教授，博士，主要从事天然产物有效成分提取及分离研究。E-mail：ruizhanchen@163.com