花生分离蛋白磷酸化改性研究

熊 柳，孙高飞，王建化，孙庆杰,*

(1.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266109；2.国家花生加工技术研发分中心，山东 青岛 266109；3.青岛东生集团股份有限公司，山东 莱西 266600；4.青岛农业大学海都学院，山东 莱阳 265200)

花生分离蛋白磷酸化改性研究

熊 柳1,2，孙高飞2,3，王建化2,4，孙庆杰1,2,*

(1.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266109；2.国家花生加工技术研发分中心，山东 青岛 266109；3.青岛东生集团股份有限公司，山东 莱西 266600；4.青岛农业大学海都学院，山东 莱阳 265200)

采用响应面优化法对花生分离蛋白进行磷酸化改性，以氮溶解指数(NSI)为指标得出花生分离蛋白磷酸化改性的最佳条件为三聚磷酸钠添加量7.77%、花生分离蛋白质量分数6.38%、反应温度44.85℃、反应体系pH8.24、反应时间5.68h。得到的花生改性蛋白NSI最大值为77.74%。改性后，花生分离蛋白的吸油性、吸水性、持水性、乳化性、乳化稳定性、泡沫稳定性都有不同程度的提高。

花生分离蛋白；磷酸化；改性

Abstract：Peanut protein isolate (PPI) was phosphorylated with sodium tripolyphosphate (STP) for the modification of its functionality. To maximize the nitrogen soluble index (NSI) of PPI, crucial phosphorylation reaction parameters including PPI concentration, STP amount, reaction temperature and time and pH were optimized using response surface methodology (RSM)combined with central composite design based on single factor design. Results showed that the optimal values of the above parameters were as follows: PPI concentration 6.38%, STP amount 7.77% (g/g protein), pH 8.24 and reaction temperature 44.85℃ for a reaction duration of 5.68 h. Under such conditions, a maximum NSI of PPI of 77.74% was obtained. The oil absorption, water absorption, water capacity, emulsifying capacity, emulsion stability, foam stability of PPI were all improved to different extent after the optimized phosphorylation.

Key words：peanut protein isolate；phosphorylation；modification

我国是花生生产大国，花生年总产量居世界首位[1]。花生是重要的食用植物油和蛋白质资源，在植物蛋白资源中居第3位，占世界植物蛋白年产量的11%[2]。随着世界性蛋白质的短缺，花生将成为人类蛋白质的主要来源之一。由于蛋白具有良好的加工功能性如乳化性、乳化稳定性、起泡性、凝胶性、水溶性等，而被广泛应用于食品加工业[3]。研究花生蛋白发现，脱脂花生蛋白粉的起泡性、吸油性、泡沫稳定性优于大豆蛋白粉，其余指标低于大豆蛋白粉，因而限制了花生蛋白粉在食品中的应用。因此，一方面开发研究专用功能性和营养特性的系列化高纯度功能性花生蛋白，可以弥补花生蛋白功能性的欠缺，另一方面可以进一步拓宽花生蛋白的应用领域。

蛋白质磷酸化已经被认为是提高蛋白功能性的有效手段。早在1941年，Sung等[4]曾用环状磷酸三钠磷酸化大豆蛋白，在pH11.5、35℃、1%环状磷酸三钠条件下，大豆蛋白中30%的丝氨酸残基被磷酸化。Matheis[5]使用多聚磷酸钠在碱性条件下对大豆蛋白进行了磷酸化。Frank等[6]用多种试剂对植物蛋白进行磷酸化，发现三氯氧磷能很大程度地提高蛋白质的经济和实用价值。Hirotsuka等[7]用三氯氧磷改性大豆蛋白以改善其功能特性。李瑜等[8]采用多聚磷酸钠对小麦面筋蛋白进行磷酸化。

本实验通过花生磷酸化对花生蛋白进行改性，改性后花生蛋白在食品工业中有较好的应用前景，尤其是在蛋白饮料工业中应用。且多聚磷酸钠早已作为食品添加剂应用于食品如肉制品工业中，从食品安全的观点来看，采用多聚磷酸钠对花生分离蛋白进行改性，是安全可行的[9]。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

花生分离蛋白(peanat protein isolated，PPI) 自制。

三聚磷酸钠(STP)、硫酸铜、高氯酸、硝酸、钼酸铵、对苯二酚 天津巴斯夫化工有限公司；硫酸钾、浓硫酸(95%)、氢氧化钠、硫酸、亚硫酸钠 莱阳康德化工有限公司。

SPM-10 型pH 计、快速水分测定仪 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；低速大容量离心机、DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；悬臂式搅拌器 巩义市英峪予华仪器厂；电热恒温水浴锅、凯式定氮装置 龙口市先科仪器公司。

1.2 方法

1.2.1 花生分离蛋白的制备

称取一定数量的脱脂花生蛋白粉，加入适量的稀碱液，浸提一定时间，经离心分离除去不溶物，上清液用盐酸调至等电点，离心分离后水洗两次，干燥、粉碎得到花生分离蛋白。

1.2.2 花生分离蛋白三聚磷酸钠(STP)改性

单因素试验基本条件：用蒸馏水把花生分离蛋白配成体积分数为7%的悬浮液，调pH8.0，添加7% STP，在40℃条件下反应，中速搅拌4h，然后调pH值至等电点，2000r/min离心15min，取沉淀部分调pH值至中性，水洗两遍，干燥、粉碎、过80目筛备用。

1.2.3 响应面设计

综合单因素试验结果，选择花生分离蛋白质量分数(X1)、STP添加量(X2)、反应pH值(X3)、反应温度(X4)、反应时间(X5)5个因素进行两水平设计。试验水平基本根据原配方向两边扩充，响应面设计因素水平见表1。

表1 响应面设计因素水平表Table 1 Variables and levels in central composite design

1.2.4 氮溶解指数(nitrogen solution index，NSI)的测定

参考GB/T 5511—1985《粮食、油料检验：粗蛋白质测定法》进行。

1.2.5 花生蛋白功能性测定

1.2.5.1 吸油性测定[10]

准确称取0.5g蛋白产品于10mL离心管中，加入3mL花生油，用玻璃棒搅拌1min后，静止放置30min，用1000r/min的速度离心25min，记下游离油的体积。

1.2.5.2 保水性测定[10]

向10g干试样中加入100mL热水，搅拌均匀，放置20min使之充分吸水，用1000r/min离心5min，去除分离水，测定残留物的质量。

1.2.5.3 吸水性[10]

准确称取0.5g样品加4mL水，用玻璃棒搅拌1min后，40℃水浴中放置30min，用500r/min离心25min，记下游离水的体积。

1.2.5.4 乳化性[11]

称取3g样品溶于50mL蒸馏水中，调节pH7.0，加入50mL花生油，在高速组织捣碎机中均质(1000～1200 r/min)2min，再1500r/min离心5min，计算乳化性。

1.2.5.5 乳化稳定性[11]

称取3g样品溶于50mL蒸馏水中，调节pH7.0，加入50mL花生油，在高速组织捣碎机中均质(10000～12000r/min)2min，置于50℃水浴中30min后，测出此时的乳化层高度，则乳化稳定性为：

1.2.5.6 起泡性与泡沫稳定性[12]

3g样品溶解于100mL蒸馏水中，调节pH7.0，然后在高速组织捣碎机中1000～1200r/min均质2min，记录下均质停止时泡沫的体积及30min后泡沫的体积。

2 结果与分析

2.1 花生分离蛋白磷酸化改性对氮溶解指数NSI的影响

2.1.1 花生分离蛋白质量分数对改性效果的影响

图1 花生分离蛋白质量分数对NSI的影响Fig.1 Effect of PPI concentration on post-phosphorylation NSI of PPI

由图1可以看出，改性后蛋白的NSI随花生分离蛋白质量分数增大先增大后减小，当花生分离蛋白质量分数达到7%时，改性后蛋白的NSI达到最大，因此选择花生分离蛋白质量分数为7%。

2.1.2 STP添加量对改性效果的影响

图2 STP添加量对NSI的影响Fig.2 Effect of STP amount on post-phosphorylation NSI of PPI

由图2可以看出，改性后蛋白的NSI随STP添加量增加先增大后减小，当STP添加量达到7g/100g蛋白时，改性后蛋白的NSI达到最大，因此选择STP添加量为7g/100g蛋白。

2.1.3 时间对改性效果的影响

由图3可以看出，当时间在2～3h之间时变化明显，且到3h时蛋白改性效果最好，之后随着时间的延长，NSI变化不是很明显，所以反应时间选择3h。

图3 反应时间对NSI的影响Fig.3 Effect of reaction time on post-phosphorylation NSI of PPI

2.1.4 反应温度对改性效果的影响

图4 反应温度对NSI的影响Fig.4 Effect of reaction temperature on post-phosphorylation NSI of PPI

由图4可以看出，随着温度的增加，改性后蛋白的NSI先增大后减小，温度达到40℃时NSI达到最大，因此反应温度选择40℃。

2.1.5 pH值对改性效果的影响

图5 反应体系pH值对NSI的影响Fig.5 Effect of reaction pH on post-phosphorylation NSI of PPI

由图5可以看出，随着pH值的增加，改性后蛋白的NSI先增大后减小，当pH值达到8时NSI达到最大值，因此pH值选择8。

由以上试验得出最佳反应条件为：花生分离蛋白质量分数7%，STP添加量7g/100g蛋白，反应体系pH8.0，反应温度40℃，反应时间3h。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验分析

表2 响应面分析试验结果Table 2 Central composite design matrix and experimental values of post-phosphorylation NSI of PPI

由图6可以看出，在所设定范围内，随着PPT添加量的增加NSI先变大后减小；由图7可以看出，在所选范围内，随着温度的升高，NSI逐渐变大；由图8可以看出，在所设定范围内，随着pH值的增加NSI先变大后减小；由图9可以看出，在所选范围内，随着时间的增加，NSI先变大后减小。

图6 花生分离蛋白质量分数和STP添加量对NSI的影响Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of PPI concentration and STP amount on post-phosphorylation NSI of PPI

图7 反应温度和花生分离蛋白质量分数对NSI的影响Fig.7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of reaction temperature and PPI concentration on postphosphorylation NSI of PPI

图8 pH值和花生分离蛋白质量分数对NSI的影响Fig.8 Response surface and contour plots showing the interactive effects of reaction pH value and PPI concentration on postphosphorylation NSI of PPI

图9 反应时间和花生分离蛋白质量分数对NSI的影响Fig.9 Response surface and contour plots showing the interactive effects of reaction time and PPI concentration on post-phosphorylation NSI of PPI

2.2.2 模型的建立及其显著性检验

利用Design-Expert(version7.0, Stat-EaseInc.,Minneapolis, MN. USA)软件对试验数据进行多元回归拟合，得到花生分离蛋白质量分数(X1)、STP添加量(X2)、反应pH(X3)、反应温度(X4)、反应时间(X5)的二次多项回归模型为：

对该模型进行方差分析，结果见表3。

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis for fitted quadratic regression equation

表4 回归方程可信度分析Table 4 Reliability analysis for fitted quadratic regression equation

由方差分析可知，花生蛋白磷酸化改性的回归模型F值为237.59，模型的F值只有0.01%的可能由噪声产生；Prob＞F＜0.0500说明模型显著，本实验Prob＞F＜0.0001，说明整个模型的回归效果极显著；X2、X3、X4、X2X3、X2X4、X22、X42对改性效果有较显著的影响，其他因素对改性效果的影响相对较小。

失拟项反应的是实验数据与模型不相符的情况，它的F值为53.13与整个模型的237.59相比是很小的，这说明不符合的数据相对纯误差是不显著的，

回归方程的复相关系数为0.9781，校正后的复相关系数的平方R2为0.9898，说明回归方程的可信度非常高，精确度反映的是噪音比率信号，只要这一值大于4就说明是合适的。此回归方程所得的值56.437 说明此模型拟合程度良好，试验误差小，可以此模型来分析和预测花生分离蛋白改性效果，说明模型完全可以用来对试验结果进行拟合。

图10 NSI最大时STP添加量和花生分离蛋白质量分数的等高线Fig.10 Contour plot showing the maximum value of postphosphorylation NSI of PPI at different levels of STP amount and PPI concentration

图11 NSI最大时反应温度和pH值的等高线Fig.11 Contour plot showing the maximum value of postphosphorylation NSI of PPI at different levels of reaction temperature and pH

图12 NSI最大时STP添加量和pH值的等高线Fig.12 Contour plot showing the maximum value of postphosphorylation NSI of PPI at different levels of STP amount and pH

由图10～12可以得出，反应的最佳条件为三聚磷酸钠添加量为7.77%、花生分离蛋白质量分数为6.38%、反应温度44.85℃、反应体系pH8.24、反应时间5.68h。得到的花生改性蛋白NSI 最大值为77.74%，在此条件下，花生改性蛋白中有机磷的含量为36.2mg/g，由于引进大量的磷酸根基团，使蛋白质加工功能性得以改善。

图13 花生蛋白粉、花生分离蛋白、花生改性蛋白功能特性Fig.13 Comparisons of oil absorption, water absorption, water capacity, emulsifying capacity, emulsion stability, foam stability among peanut protein powder and unmodified and modified PPI

2.2.3 改性效果

从图13可以看出，通过三聚磷酸钠改性后，花生分离蛋白的功能特性除了起泡性以外都有不同程度的提高，花生改性蛋白吸油性比花生分离蛋白的吸油性提高了14.3%，吸水性提高了150%，持水性提高了8.9%，溶解性提高了55%，乳化性提高了13.4%，乳化稳定性提高了10.3%，起泡性降低了50%，泡沫稳定性提高了124%。三聚磷酸钠对花生分离蛋白的改性具有显著性差异。

3 结 论

本实验得出花生分离蛋白磷酸化改性反应的最佳条件为三聚磷酸钠添加量7.77%、花生分离蛋白质量分数6.38%、反应温度44.85℃、反应体系pH8.24、反应时间5.68h。得到的花生改性蛋白NSI最大值为77.74%。改性后，花生分离蛋白的功能特性除了起泡性以外都有不同程度的提高。由此可以看出，三聚磷酸钠对花生分离蛋白的改性具有显著效果，改性的花生分离蛋白可以广泛应用于植物蛋白饮料和肉制品工业。

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Phosphorylation with Sodium Tripolyphosphate for Modification of Peanut Protein Isolate

XIONG Liu1,2，SUN Gao-fei2,3，WANG Jian-hua2,4，SUN Qing-jie1,2,*
(1. College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China；2. National Research and Development Center for Peanut Processing, Qingdao 266109, China；3. Qingdao Topsen Group Co. Ltd., Laixi 266600, China；4. Haidu College, Qingdao Agricultural University, Laiyang 265200, China)

Q816

A

1002-6630(2010)10-0035-07

2009-07-24

国家星火计划项目(2007EA741007)；青岛市2007年重点技术创新项目(20071359)

熊柳(1975—)，女，硕士研究生，研究方向为粮油加工。E-mail：xiongliu821@163.com

*通信作者：孙庆杰(1970—)，男，教授，博士，研究方向为粮食油脂及植物蛋白工程。E-mail：phdsun@163.com