皮肤组织中SOD活性测定的样品制备方法

潘卫松 ，肖 瑛 ，李 薇

（1.广州市药品检验所，广东广州 510610；2.暨南大学药学院，广东广州 510632；3.暨南大学中药药效物质基础及创新药物研究广东省高校重点实验室,广东广州 510632）

超氧化物歧化酶（SOD）是生物机体内重要的自由基清除酶，其活性的高低表征着机体的抗氧化能力和衰老程度。目前实验室里比较普遍的SOD测定方法是黄嘌呤氧化酶法[1]。病理改变的过程中，机体功能改变一般是先于结构变化的，因此评价化妆品和药物是否确实能够延缓皮肤组织的衰老，皮肤组织中的SOD活性是一个有意义的评价指标。由于皮肤组织中SOD活性测定方法的报道较少，目前市面上SOD试剂盒也无法直接测出大鼠皮肤组织中SOD酶的活性，因此本研究以南京建成生物工程公司的SOD试剂盒为基础，建立了测定皮肤组织中SOD活性的方法，为评价化妆品、保健品和中药的功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性Wistar大鼠 6只，由广州中医药大学实验动物中心苏小茹老师提供；动物合格证号：粤监证字2005A008。

1.2 仪器和试剂

电动玻璃匀浆器（江苏金坛市佳美仪器厂）；SCJ10005低温高速离心机；紫外分光光度计 （CARY 100）；恒温水浴（GRANT SUB14）；MSI旋涡混合器 （广州 IKA 公司）；SOD 试剂盒（南京建成生物工程公司，批号：20070126）；牛血清白蛋白（Biotech 级，AMRESCO 公司，批号：303903A）；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 方法

大鼠取皮肤组织约0.5 g，加预冷的生理盐水，置电动玻璃匀浆器中，在冰浴中匀浆8 min，制成10%的皮肤匀浆液。将匀浆液平分成两份，分别以3 000 r/min，0℃离心10 min和15 min，所得上清液即为粗酶液。然后分别取粗酶液加入底物溶液，以旋涡混合器振荡0.5min，使之混合均匀后置37℃恒温水浴40min后，取出加入显色剂，在旋涡混合器上混匀，室温放置10 min后，在550 nm处测定吸光度。同法平行制备空白管，作为空白对照。以对照管吸光度减去反应管吸光度的差值比上对照管吸光度值的结果计算SOD的活性。粗酶液以考马斯亮蓝法[2]测定其中蛋白含量，以牛血清白蛋白溶液做标准曲线。

2.2 结果

不同测定条件下SOD酶的百分抑制率见表1。6个不同条件下的SOD酶的百分抑制率均为15%～55%。蛋白定量的标准曲线：Y＝1.783 4X－0.136 6（r＝0.991 5），线性范围为 0.2～1.6 mg/ml。各个条件下的粗酶液的蛋白含量见表2。由表1、2可知，在转速为3 000 r/min时，离心时间的长短对粗酶液中蛋白含量没有明显的影响。

表1 不同测定条件下SOD酶的百分抑制率（±s，%）

表1 不同测定条件下SOD酶的百分抑制率（±s，%）

离心时间（min） 取样量（μl）60 80 100 10 15 40.66±5.89 34.32±7.37 42.00±7.03 37.85±3.63 46.55±3.53 43.00±4.74

表2 不同测定条件下SOD粗酶液的蛋白含量（±s，mg/ml）

表2 不同测定条件下SOD粗酶液的蛋白含量（±s，mg/ml）

离心时间 10 min 15 min 1.002 8±0.325 7 1.042 9±0.367 0蛋白含量

3 讨论

药品评价正日益受到重视，针对药品，保健品和化妆品的安全性和有效性、功能性评价得到了广泛开展[3-6]。目前国内药品、保健品和化妆品对抗皮肤衰老功效评价的实验研究尚少见报道。笔者在进行有关中药抗皮肤衰老的评价时，选择测定皮肤组织中SOD酶的活性来评价此类中药的功效。经过比较市面上现有的SOD试剂盒后，笔者选择了南京建成生物工程公司生产的SOD试剂盒来测定大鼠皮肤组织中的SOD活性。预实验发现，如果完全按照试剂盒说明书的要求，取30～50 μl所制备的1%皮肤组织匀浆液将无法测出SOD活性。因此本研究通过改进样品处理方法以建立测定皮肤组织中SOD活性的方法。

经过预实验，笔者选择制备10%的皮肤组织匀浆，经过0℃，3 000 r/min，10 min或15 min的离心制备SOD的粗酶液，然后分别取60、80和100 μl的样品测定皮肤组织中SOD酶的活性，从中选取最佳的测定条件。结果表明所测定的SOD酶百分抑制率均在15%～55%范围内。由于酶活测定的最佳取样量为百分抑制率在48%～50%，故在上述结果中，SOD酶活测定的最佳条件是在0℃，3 000 r/min条件下离心10 min之后，取上清液100 μl进行测定。

在测定全血和肝、脑组织中SOD酶活的过程中，笔者使用双缩脲法测定样品中的蛋白含量，但皮肤组织的匀浆液在离心后，其蛋白含量低于双缩脲法的线性范围，于是笔者采用考马斯亮蓝法来测定皮肤组织中SOD酶的粗酶液的蛋白含量。 结果表明，该法回归曲线的线性范围为 0.2～1.6 mg/ml，标准曲线的相关系数r=0.991 5，能够满足测定SOD酶粗酶液中蛋白含量的要求。

通过本实验，笔者建立了利用南京建成生物工程公司SOD试剂盒来测定皮肤组织中SOD活性的方法，为评价中药和化妆品对皮肤组织的抗氧化和抗衰老功能奠定了基础。

[1]李忠琴,许小平,杨海麟,等.辣根过氧化物酶分光光度法测定黄嘌呤氧化酶的活性[J].分析化学,2006,34(6)∶821-824.

[2]John A,Smith.精编分子生物学实验指南[M].北京∶科学出版社,332-333.

[3]肖斌,张新兰.从药品评价平台建设看我国科技评价的发展趋势[J].中国医药导报,2010,7(5)∶5-6.

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[5]房林,赵振民.皮肤衰老机制的研究进展[J].北京∶人民军医,2010,53(2)∶149-152.

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