高效液相色谱法测定忍冬藤不同采收期中绿原酸和咖啡酸的含量

李江

(江苏省徐州市中医院，江苏徐州 221003）

忍冬藤为忍冬科植物忍冬（Lonicera Japonica Thunb.）的干燥茎枝，具有清热解毒，疏风通络的功效，用于温病发热，热毒血痢等症状[1]。 现代化学、药理研究表明，忍冬藤中的主要活性成分为有机酸类。由于绿原酸具有一定的抗菌抗感染作用[2-4]，而且在忍冬藤中含量较高，为其主要活性成分之一，因此，对忍冬藤的质量控制研究仍主要以绿原酸的含量为指标[5-8]。但是，至今尚未见到忍冬藤中有关采收期的研究报道。本文基于中药中多成分、多靶点协调作用的特点，建立了HPLC-UV分析方法，同时对忍冬藤中绿原酸和咖啡酸进行分析测定，并应用该方法对忍冬藤的不同采收期样品进行了含量测定，为忍冬藤的采收期及质量控制提供了参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱系统为Aglient 1100 HPLC system，包括在线脱气四元泵，自动进样器，紫外检测器，柱温箱，色谱柱为UltimateTMXB-C18（4.6 mm ×150 mm，5 μm）；JP300 型超声波提取器（武汉嘉鹏电子有限公司）；十万分之一电子天平（瑞士梅特勒电子天平）。

1.2 试药

绿原酸对照品和咖啡酸均购于中国药品生物制品检定所。实验用水（农夫山泉矿泉水），甲醇、乙腈为色谱纯，甲酸为分析纯。忍冬藤不同采收期样品由我院制剂中心植物园采集，经鉴定为忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥藤茎。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

流动相：A相为0.3%甲酸，B相为乙腈，流速：1.0 ml/min，检测波长：327 nm，柱温：25℃，洗脱条件：12∶88（甲酸水-乙腈）。理论塔板数按绿原酸计算，应不低于2 000。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取忍冬藤药材粉末1.0 g，置具塞锥形瓶中，加25 ml 50%甲醇（v/v），超声提取30 min，再用50%甲醇补重，药液过微孔滤膜（0.45 μm），进样 10 μl，进行测定。

2.3 标准曲线的制备

精密称取各对照品适量，置于5 ml量瓶，甲醇溶解，定容，配制成1 mg/ml的混和标准品贮备液。精密吸取混和标准品贮备液适量，按上述色谱条件进行分析测定，以峰面积值（Y）为纵坐标，对照品实际进样量（X）为横坐标，进行回归计算。 绿原酸的标准曲线：Y=2 241.5X＋9.8（r=0.999 6）， 线性范围为2.5～125.0 μg/ml。 咖啡酸的标准曲线：Y=3 635.3X-7.5（r=0.999 5）， 线性范围为 1.2～60.0 μg/ml。 结果表明，2 种成分在检测范围内线性关系良好。

2.4 精密度试验

取混合对照品溶液，按样品测定项下色谱条件进行HPLC分析，重复进样5次，进样量为10 μl，记录峰面积，计算含量的相对标准偏差（RSD），RSD小于2.0%，结果表明日内精密度良好。

2.5 重复性试验

精密称取同一采收期的5份相同的忍冬藤样品粉末，按照样品测定项下方法进行测定，得到相应的峰面积，计算出药材中各成分含量，其RSD小于2.5%，重现性良好。

2.6 稳定性试验

精密称取忍冬藤药材粉末1.0 g，按样品测定项下方法进行测定，每3小时测定1次，共测5次，计算峰面积的RSD，RSD小于3.0%，表明样品具有良好的稳定性。

2.7 加样回收率试验

精密称取0.50 g的5份已知含量的忍冬藤药材粉末，分别加入对照品溶液适量，按“2.2”项下方法制备供试液并分析，加样回收率在 96.0%～104.6%，RSD 小于 4.0%。

2.8 样品含量测定

按“2.2”项下方法制备样品，进样 10 μl，计算含量，色谱图见图1，结果见表1。

表1 忍冬藤含量测定结果（n=3）Tab.1 Results of content determination of Caulis lonicerae(n=3)

3 讨论

3.1 提取方法及溶液稳定性的考察

笔者考察了超声提取、回流提取、索式提取三种提取方法，含量测定结果相当，超声提取时间短，故采用超声提取法制备样品。酚酸类溶液随着时间的放置，会变得不稳定，但放在棕色瓶中，在24 h内基本是稳定。

3.2 含量测定结果

从表1的含量测定结果来看，忍冬藤的不同采收期内，绿原酸的含量普遍高于咖啡酸的含量。比较不同的采收期可以发现，不同时期药材中化合物的含量存在很大的差异。如在九月至十二月的采收期内，十月采收的样品含量较高，十二月采收的较低。故选择不同的采收时间，对忍冬藤的质量控制至关重要。

本文建立和测定了忍冬藤不同采收期中酚酸类活性成分含量的HPLC方法，该测定方法的精密度、重复性及稳定性均较好，并利用建立的分析方法成功的测定了忍冬藤不同采收期药材的含量，说明该方法可以用于忍冬藤的质量控制。

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[2]武雪芬,白雁.金银花叶药用成分的提取及抑菌试验研究[J].中成药,2001,23(6)∶448.

[3]武雪芬.金银花叶提取物的抗氧化作用研究[J].河南化工,1999,(10)∶10.

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