三氯化铝对小鼠认知功能的影响

袁晋峰,潘宝龙

近年来研究表明,一些神经退行性疾病如透析性脑病综合征、老年性痴呆(AD)、肌萎缩性侧索硬化症(AIS)等可能与铝毒性有关[1]。铝是一种对人体有害的元素,随着铝矿开采、炼铝工业发展、铝制品的制作加工使用、酸雨频繁发生、食品添加剂的广泛应用等,铝以各种形式通过呼吸道、消化道等多种途径进入人体,铝作业工人以及普通人群的机体内铝负荷越来越高。研究发现,进入机体的铝以Al(H2O)3+形式与转铁蛋白、白蛋白或枸橼酸离子相结合,随血液分布与脑、肝、肾、骨、肺等组织中,长期接触铝,可在脑组织中蓄积,干扰脑细胞活动,破坏神经元结构,导致中枢神经功能障碍[2,3]。因此,研究三氯化铝(AlCl3)对认知功能的影响有理论和现实意义。

跳台试验、避暗试验和水迷宫试验是最常用的评价药物对学习记忆的几种动物模型[4]。记忆过程分为记忆获得(acquisition)、巩固(consolidation)和再现(retrieval),并且此 3个过程有先后次序,即首先是记忆获得,然后巩固,最后是再现[5]。根据记忆形成的特点,如果多次反复予以刺激往往会加强记忆[6,7]。在评价药物对记忆巩固影响的跳台试验、避暗试验的模型中,根据记忆形成的特点,当小鼠被反复置于相同环境和接受多次电刺激时,无疑会加强记忆的巩固。但如果小鼠出现相对于阴性对照组潜伏期缩短和错误次数增加,可以认为该药物对小鼠记忆的巩固有影响。同理,在水迷宫试验中则表现为潜伏期的延长和穿越平台次数减少。

本实验通过跳台试验、避暗试验和水迷宫试验检测小鼠的认知功能,探讨三氯化铝对小鼠认知功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 断乳昆明种小白鼠(由山西医科大学动物中心提供),雌雄各半。随机分为对照组与低、中、高剂量组,每组8只。小鼠跳台反射箱,小鼠避暗反射箱,Morris水迷宫(中国科学院药物研究所研制)。

1.2 实验方法

1.2.1 染毒方法 动物模型低剂量组、中剂量组、高剂量组分别饲喂含AlCl3饲料1.2mg/(kg◦d)、12mg/(kg◦ d)、120 mg/(kg◦d),对照组正常饲养。染毒9个月后,进行小鼠认知功能检测。

1.2.2 认知功能检测

1.2.2.1 小鼠跳台试验 将小鼠置于反射箱中适应2 min,在底部铜栅通电的情况下,直接将动物置于平台上,记录小鼠被放上平台到第一次跳下的时间,称为LT,小鼠受电击会逃避性跳上平台,然后记录 5 min内小鼠跳下平台次数,即错误次数(EN),LT和EN共同作为记忆成绩。

1.2.2.2 小鼠避暗试验 反射箱分单独5个箱,每个箱大小为36 cm×12 cm×12 cm。将小鼠放入反射箱中适应2 min,24 h后在暗室铜栅通电的情况下,将小鼠置于明室,记录小鼠从明室第一次进入暗室的时间,称为潜伏期(LT),小鼠受电击后会逃避性跑出暗室,然后记录5 min内错误次数(EN),LT和EN共同作为记忆成绩。

2.2.3 Morris水迷宫试验 迷宫上方安置带有显示系统的摄像机,计算机自动跟踪计时并记录游泳轨迹。定位航行试验,试验历时5 d,每天训练4次。4次潜伏期成绩的平均值作为当日最终成绩进入最后统计。空间探索试验(Spatial probe test),第5天下午进行空间探索试验,撤除平台,将受试小鼠在西北象限池壁中点面向池壁放入水中,记录60 s内小鼠穿越平台的次数作为小鼠的记忆成绩。

2 结 果

2.1 小鼠跳台试验检测结果 与对照组相比,高、中剂量组小鼠跳台试验错误次数增多(P＜0.05),高、中剂量组与对照组相比潜伏期缩短,差异有统计学意义(P＜0.05)。详见表1。

表1 各鼠小鼠跳台试验结果(±s)

表1 各鼠小鼠跳台试验结果(±s)

组别 n 潜伏期(s) 错误数(次)对照组 8 141.50±68.67 0.43±0.65低剂量组 8 94.07±47.64 0.71±0.83中剂量组 8 47.31±15.881) 1.56±1.031)高剂量组 8 20.50±11.771) 1.93±1.071)与对照组比较,1)P＜0.05

2.2 小鼠避暗试验检测结果 与对照组相比,高、中剂量组小鼠避暗试验错误次数增多(P＜0.05);高、中剂量组与对照组相比潜伏期缩短(P＜0.05)。详见表2。

表2 各组小鼠避暗试验结果(±s)

表2 各组小鼠避暗试验结果(±s)

组别 n 潜伏期(s) 错误数(次)对照组 8 227.57±32.46 0.43±0.65低剂量组 8 199.57±39.63 0.57±0.85中剂量组 8 125.56±48.351) 1.31±1.011)高剂量组 8 81.36±37.191) 1.64±1.341)与对照组比较,1)P＜0.05

2.3 Morris水迷宫试验 定位航行实验,经多组比较单因素方差分析,各组平均潜伏期差异有统计学意义(P＜0.05),与对照组相比,高剂量组平均潜伏期增加(P＜0.05)。空间搜索实验,经多组比较的单因素方差分析,各组穿越平台的次数差异有统计学意义(P＜0.05),与对照组相比,中剂量组、高剂量组穿越平台的次数与对照组相比明显减少(P＜0.05)。详见表3。

表3 小鼠Mo rris水迷宫潜伏期试验结果(±s)

表3 小鼠Mo rris水迷宫潜伏期试验结果(±s)

组别 n 水迷宫潜伏期(s)第1天 第2天 第3天 第4天 第5天穿越平台次数次对照组 8 49.5±6.9 37.4±5.2 28.8±5.0 22.5±6.4 16.8±4.4 6.57±1.21低剂量组 8 52.9±6.5 43.7±5.6 32.5±6.6 25.2±5.9 21.6±5.7 5.00±0.63中剂量组 8 53.3±4.8 45.0±6.3 34.1±5.3 28.1±5.9 22.4±6.41) 3.50±0.541)高剂量组 8 58.0±3.51) 50.4±7.71) 43.0±6.31) 41.7±6.11) 39.8±5.91) 2.18±1.221)与对照组比较,1)P＜0.05

3 讨 论

铝化合物具有神经毒性作用,可以诱发神经变性,大量资料表明铝可通过血脑屏障进入脑组织,导致学习记忆障碍,并与AD等神经退行性疾病有关,铝可引起神经细胞凋亡,铝对学习记忆过程的细胞信使和信使分子有明显影响,铝直接损伤记忆的生理基础——突触可塑性[8]。铝对组织器官的损伤作用在临床上和动物实验中都得到了广泛证实[9-11]。Rankin等指出摄食过程中进行铝暴露的大鼠其后代有行为上和神经生化上的改变。流行病学研究显示,环境铝水平增高,特别是饮水中铝浓度升高与认知损害和痴呆有一定关系[12-14]。据相关慢性动物实验显示,脑、脊髓等组织中铝含量和铝注射量呈正相关,在脑毛细血管、内皮细胞和脑组织中都有铝的存在,以前顶皮质、海马和纹状体最多。相关研究发现,长期饮有高浓度的AlCl3溶液可使小鼠脑湿重明显减轻,研究结果显示,慢性铝中毒使大鼠的空间分辨学习记忆能力和运动能力明显降低。

铝对学习记忆的抑制作用已在实验和临床上得到证实。但以往对铝的神经毒性研究多采取急性暴露或体外实验方法,少数慢性毒性研究则常以腹腔注射或灌胃方式为主,与人体实际情况下经水或食物的慢性摄铝方式不符。本次研究以饲料中添加AlCl3的方式对断乳小鼠进行染毒9个月后,对小鼠进行认知功能检测。检测跳台试验潜伏期和错误次数共同作为记忆成绩。避暗试验,潜伏期和错误次数共同作为记忆成绩。水迷宫试验:①定位航行试验潜伏期;②空间探索试验撤除平台后,记录60 s内小鼠穿越平台次数作为小鼠记忆成绩。跳台试验、避暗试验是根据记忆形成特点,将小鼠反复置于相同环境并接受多次电刺激,无疑会加强记忆的巩固。实验结果显示,中剂量组和高剂量组相对于对照组潜伏期缩短且错误次数增加,可以认为三氯化铝对小鼠记忆巩固有影响。在水迷宫试验中则表现为相对于对照组,中、高剂量组潜伏期延长和穿越平台次数减少,高剂量组与对照组差异更加明显。铝可引起脂质过氧化增强和自由基增多,可直接损伤各种酶类、载体、受体、通道和蛋白质,进而影响长时程增强(LTP)的形成和维持,影响学习记忆。本次研究结果显示,慢性铝中毒使小鼠的空间分辨学习记忆能力和运动能力明显降低,和以往研究结果相符。

本次研究表明,三氯化铝可引起小鼠认知功能障碍,摄入三氯化铝量越大,对小鼠认知功能影响越大,可以推测三氯化铝可以引起小鼠认知功能障碍,但其具体机制有待进一步研究。

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