人工寒潮对高血压大鼠脑内ET、CGRP、TF和TM 的影响

翟俊格,李常新,吴晓巍,王慧芳,祁玉凤,高润兰

众所周知,脑卒中好发于秋末冬初。在寒冷季节,尤其是气温骤降时,发病明显增多[1],提示寒潮可能影响某些与发病相关的因子,使之发生变化而致病。因此寻找寒潮诱发脑卒中的发病因素,对其防治具有重要的临床意义。本研究通过建立易卒中型肾血管性高血压大鼠(stroke-prone renovascular hypertensive rats,RHRSP)模型并模拟自然界寒潮,观察脑卒中发生情况,采用免疫组化方法检测大鼠脑组织内皮素(endothelin,ET)、降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)、组织因子(tissue factor,TF)及血栓调节蛋白(Thrombomodulin,TM)变化,探索寒潮诱发脑卒中可能的发病机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与模型制备 选用健康的雄性封闭群Sprague Dawley(SD)大鼠 120只,鼠龄 60 d～ 90 d,体重 80 g～ 120 g,由山西医科大学动物实验中心提供。以颗粒型大鼠饲料喂养,饮用自来水,动物房温度控制在20℃左右,光暗周期24 h,为正常昼夜节律。80只大鼠用双肾双夹法复制RHRSP模型[2];40只采用开腹分离肾动脉、不夹闭的假手术方法,其余操作步骤同模型复制。

1.2 神经行为学评分 按Longa 5分制法由2人同时对大鼠进行行为学评分。规定Longa评分≥1分为脑卒中。

1.3 血压测定与动物分组 用SDP-1型大鼠心率血压计(中日友好医院研制)测量大鼠尾动脉收缩压,术前3 d连续测血压作为基础血压,术后每 2周测血压1次,观察 12周。术后 2周血压较术前增高20 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)以上为模型复制成功标准。随机从复制成功的RHRSP模型中取出36只作为高血压组,在假手术方法大鼠中选36只作为假手术组。

在术后12周时,剔除饲养过程中Longa评分≥1分的4只大鼠(已发生脑卒中),从复制成功的76只 RHRSP模型中选取Longa评分为0、体重 270 g～330 g的RHRSP大鼠60只,随机分为寒潮组和非寒潮组,每组均为30只。

1.4 人工模拟寒潮 按照气象局规定的标准,寒潮定义为日平均气温在24 h内急剧降温8℃或以上(48 h内降温10℃或以上),而且整个过程最低气温≤5℃。利用改装的RXZ-300A型智能人工气候箱(宁波江南仪器厂)模拟寒潮,在此过程中用WS508B温湿度表(北京市亚光仪器有限责任公司)验证温度及相对湿度,以判定控制温湿度的偏差。人工气候箱中,保持60%的相对湿度,寒潮温度设置以22℃12 h,4℃12 h为1 d循环,共3 d。不经历人工寒潮者,作为非寒潮组。

1.5 标本的取材、制备及免疫组化检测 分别在寒潮时3 h、6 h、12 h及寒潮后12 h、24 h的时段每组各取6只处死,并在处死前进行Longa评分。将所取大鼠麻醉后,快速断头取脑,先观察记录出血灶发生情况,再经1%TTC溶液染色后大体观察梗死灶情况。制备石蜡切片,HE染色,光镜检查病理改变。

取相邻切片采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法检测各抗体的表达,严格按试剂盒(大鼠SP免疫组化试剂盒及显色试剂盒均系北京中山生物技术有限公司产品)提供的实验步骤进行操作。图像应用Kontron IBAS全自动图像分析系统(德国)进行定量分析,测定观察部位相对灰度的平均值,应用免疫组织化学定量计算公式[3],得出阳性单位(PU)值。

1.6 统计学处理 全部数据采用SPSS 13.0统计软件包。计量资料用均数±标准差(±s)表示,采用 t检验;计数资料采用χ2检验。

2 结 果

2.1 血压变化 高血压组术后血压升高,在各时间点血压明显高于术前(P＜0.05);假手术组术后血压值略有波动,高血压组血压明显高于假手术组(P＜0.05)。详见表1。

表1 两组不同时段血压变化(±s)mmHg

表1 两组不同时段血压变化(±s)mmHg

组别 术前 术后2周 术后4周 术后6周 术后8周 术后10周 术后12周高血压组 120.71±12.67 137.81±14.301)2) 147.20±16.181)2) 155.72±18.141)2) 170.16±14.691)2) 179.21±19.471)2) 182.64±18.771)2)假手术组 122.30±11.28 124.42±14.43 125.30±13.39 124.61±12.78 125.71±14.76 123.81±13.35 125.60±15.12与假手术组比较,1)P＜0.05;与同组术前比较,2)P＜0.05

2.2 寒潮后卒中情况 寒潮组共6只发生卒中,非寒潮组共1只发生卒中,两组卒中发病率比较无统计学意义。7只脑卒中大鼠共有11个病灶,其中寒潮组中1只有 2处梗死灶、3只各有2处出血灶,其余2只大鼠各有1处梗死灶;非寒潮组1只有1处梗死灶。共有梗死灶 5个(多为小病灶),出血灶6个(多为点状出血灶),其中分布在皮质或皮质下白质的病灶8个,基底节区2个,其他部位1个。寒潮组与非寒潮组的病灶数比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 免疫组化法检测ET和CGRP的表达 寒潮后12 h、24 h,与非寒潮组比较,CGRP含量变化无统计学意义。在寒潮时段3 h、6 h、12 h,与非寒潮组比较,寒潮组 ET和 CGRP的含量明显增高(P＜0.05)。详见表2。

表2 两组ET和CG RP在不同时间点的表达(±s)

表2 两组ET和CG RP在不同时间点的表达(±s)

组别 ET CGRP寒潮组 寒潮3 h 19.44±4.621) 18.67±5.211)寒潮6 h 17.46±4.171) 17.85±4.051)寒潮12 h 16.96±3.251) 16.46±3.971)寒潮后12 h 15.54±3.22 15.67±4.20寒潮后24 h 15.24±3.14 14.82±3.80非寒潮组 寒潮3 h 13.47±3.83 19.48±4.86寒潮6 h 13.21±3.83 18.86±3.93寒潮12 h 12.68±3.83 18.50±3.59寒潮后12 h 12.18±2.90 17.70±3.76寒潮后24 h 12.10±2.79 17.54±3.53与非寒潮组同时间比较,1)P＜0.05

2.4 免疫组化法检测TF和TM的表达 在寒潮时段3 h、6 h、12 h,与非寒潮组相比,寒潮组TF和TM 的含量明显增高(P＜0.05)。详见表4。

表3 两组T F和T M在不同时间点的表达(±s)

表3 两组T F和T M在不同时间点的表达(±s)

组别 TF TM寒潮组 寒潮3 h 24.64±5.221) 20.27±4.261)寒潮6 h 22.83±5.121) 19.22±3.711)寒潮12 h 21.07±4.451) 18.04±4.821)寒潮后12 h 20.91±4.75 17.65±3.66寒潮后24 h 19.38±4.32 16.05±3.04非寒潮组 寒潮3 h 16.24±4.23 14.02±3.81寒潮6 h 15.64±4.63 13.25±2.88寒潮12 h 14.71±4.01 13.03±2.35寒潮后12 h 14.23±3.72 12.87±3.10寒潮后24 h 14.07±3.44 12.06±2.79与非寒潮组同时间比较,1)P＜0.05

3 讨 论

长期慢性高血压可促进动脉硬化、动脉粥样斑块或微动脉瘤形成,若血管内皮细胞受刺激或受到损伤时,凝血因子被活化或含量增高,抗凝因子含量减少,常伴有血液黏度增高和血流减慢等血流动力学变化[4],在此基础上气温的骤降或过大波动可能诱发缺血性脑卒中的发生[5]。本研究使用RHRSP,血压稳定升高,可很好模拟临床高血压的发病过程,用此模型进行脑卒中及其相关研究结果可靠。利用改装的人工气候箱模拟自然界的寒潮,观察寒潮对脑卒中发生的影响,并进行相关因子的检测,以求更深入探索其致病机制。

ET和CGRP可强烈调节血管舒缩,其作用相互拮抗,前者在中枢神经系统中(下丘脑和纹状体)含量最高,能使血管剧烈收缩,同时它也是内源性的致损伤因子,其水平可反映脑组织的损伤程度[6]。CGRP分布在中枢和外周神经系统以及血管等组织[7],是体内最强的舒血管多肽,能拮抗ET作用,使血管舒张,属于内源性保护因子,在病理条件下抑制ET大量释放,还能对ET的生物效应产生拮抗作用。本研究中,寒潮组ET和CGRP的含量在寒潮时段均发生变化,推测寒冷刺激机体可出现强烈的应激反应,交感神经兴奋,释放儿茶酚胺等神经递质,引起动脉收缩。在慢性高血压引起血管病变的基础上,可能导致动脉粥样硬化斑块破裂或出血,损伤血管内皮,诱发ET的表达和释放,从而更加剧血管收缩;此时作为机体可能的一种代偿调节[8],拮抗因子CGRP的含量也相应升高,使血管舒张,以提高脑血流量,减轻缺血缺氧从而减轻脑组织损伤。

TF和TM也是作用相反的功能因子,在凝血、抗凝系统中起重要作用。TF是外源性凝血的启动因子,血管内皮细胞与血细胞均不能表达[9],因此生理条件下含量极低。TM是凝血酶受体,具有抗凝活性,由血管内皮细胞合成,是反映血管内皮细胞损伤的分子标记[10]。

本研究中,寒潮组在寒潮时段TF和TM的含量均明显增高。提示寒冷刺激使血管收缩,若损伤血管内皮细胞或使粥样硬化斑块破裂时,血浆中TM水平可增高[11],抗凝作用增强,局部微环境凝血、抗凝作用平衡被打破,导致局部组织出血;同时作为机体的代偿调节,具有拮抗作用的TF由巨噬细胞及碎片大量释放入血,可启动外源性凝血途径发挥生理性止血作用[12]。由于长期持续高血压可能影响机体的凝血/纤溶系统及血管舒缩反应能力[13,14],致相应的应激调控功能降低。经历寒潮刺激,收缩/舒张或凝血/抗凝系统可能均被激活,ET、CGRP、TF和TM的含量增高使局部微环境发生变化,局部内环境失去稳态,从而有诱发脑卒中发生的可能。提示寒潮可能通过上述因子动态变化或调节紊乱促使脑卒中的发生。所以在临床上建议高血压患者在冬季应有效地预防突发寒冷刺激,并采取适宜的措施,以减少或避免发生脑卒中。

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