细胞代数与5-氮胞苷浓度对体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞定向分化的影响1)

王 宁,李新华,邢万红,陈 平

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞[1],它广泛存在于成体器官和结缔组织中[2],最早发现于骨髓[3]。骨髓来源的间充质干细胞是一种比较原始的骨髓基质细胞,被称为骨髓间充质干细胞/祖细胞(bone marrow-mesenchymal stem cells,BM-MSCs),也被称为骨髓来源的多潜能基质细胞[4]。自从Wakitani等报道MSCs可以分化为心肌细胞,M angi等[5]报道MSCs可以修复损伤的心脏以来,MSCs成为心脏修复和心肌组织工程种子细胞最热门的候选来源。但其骨髓中的含量很低,仅占骨髓中单个核细胞的1/106～1/105。细胞在扩增过程中保持多潜能性,但该能力会随着过度扩增和不恰当操作而减弱[4],因此本实验探讨大鼠MSCs细胞代数对增值与诱导分化能力的影响,及在能获得充足细胞数量的同时,又不减弱细胞多潜能性的最佳时期。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料 清洁级雄性SD大鼠,4周龄,体重100 g～120 g,由山西医科大学动物实验中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。胎牛血清(美国HyClone公司);5-氮胞苷(5-Azα,美国 Sigma公司);噻唑兰(M TT,美国Sigma公司);一抗:兔抗鼠cT nT抗体(上海蓝基生物科技有限公司),兔抗鼠α-action抗体(上海蓝基生物科技有限公司);过氧化物酶标记的链霉素卵白素染色试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司)。

1.2 大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养 CO2窒息处死动物,无菌条件下取大鼠股骨和胫骨,以完全培养液冲洗骨髓腔。按照1:1的比例将上述细胞悬液缓慢滴加到密度为1.077 g/mL的Percoll分离液上层,1 500 r/min离心30 min。吸取上、中层液面间的乳白色云雾状的单个核细胞层,加入完全培养液重悬,离心洗涤2次。加入培养液以2×105/cm2～3×105/cm2

细胞密度接种于细胞培养瓶,置于37℃,5%CO2,饱和湿度的孵箱内培养 72 h换液,达60%～70%融合状态,传代培养。

1.3 各代大鼠骨髓间充质干细胞增殖率测定及体外诱导 取第2代MSCs,消化后调整细胞悬液浓度至3×104/mL,接种于7个96孔板,每孔加入200 L,设调零孔5个。5%CO2,37℃孵育4 h待细胞贴壁。于贴壁后每天各取一板,每孔加入20 μ L M TT溶液(5 mg/mL,即 0.5%M TT),37℃继续孵育4 h后吸取孔内上清液弃去。每孔加入150μ L二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使紫色结晶充分溶解。在酶联免疫检测仪上490 nm波长下测量各孔的吸光值(OD值),记录结果。选取第2代、第 6代、第10代 MSCs以3×104/mL细胞密度分别接种于96孔板,每代种植3板,贴壁12 h。每板分为4组,每组23孔,余4孔为调零孔。每板取3组为诱导组,分别以含 5μ mol/L、10μ mol/L 、15μ mol/L 5-氮胞苷的完全培液孵育24h,对照组每板23孔以完全培液孵育24 h,后改用完全培养液培养5 d。采用 MTT法,测取诱导后各代细胞第 1天、第3天、第5天的OD值。同时取第2代、第 6代、第10代细胞,以含5 μ mol/L、10μ mol/L、15 μ mol/L 5-氮胞苷的完全培养液诱导 24 h后,培养4周,并设未诱导组为阴性对照。

1.4 细胞形态学观察 倒置显微镜观察各组细胞的形态学变化和生长情况。

1.5 心肌特异性蛋白cTnT、α-Actin的检测 将诱导培养4周的第2代、第6代、第10代细胞玻片,PBS清洗后4%多聚甲醛室温固定 30 min。蒸馏水冲洗 3次,每次3 min。3%H2O2去离子水孵育5 min～10 min。滴加山羊血清室温孵育10 min,倾去勿洗。滴加适当比例稀释的一抗,4℃过夜。PBS清洗,3 min×3次;滴加生物素化二抗工作液(IgG/Bio),37℃孵育10 min。PBS清洗,3 min×3次;滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃孵育10 min。PBS清洗,3 min×3次;DAB显色。冲洗、复染、脱水、透明、封片。

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对样本资料进行分析,数据以均数±标准差(±s)表示,采用方差分析,组间两两比较进行SNK法检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 骨髓间充质干细胞的分离培养和形态学观察 通过密度梯度离心法获得的MSCs,接种于完全培养基中,48 h呈现为短纺锤、三角形短小细胞,细胞折光性好,可见黏附于细胞表面的Percoll颗粒。72 h成为细长纺锤、细长梭形细胞。第4天,细胞开始增殖,伴有较多的折光双联体,并形成小岛状克隆,细胞密度较低时,细胞排列不规则,可见三角形细胞。7 d～10 d可达70%～80%融合状,细胞排列开始规整,呈束状、旋涡状或鱼群状。细胞传至第2代,细胞形态趋于一致,细胞呈成纤维细胞样。传至第6代,可见少量圆形扁平细胞,约占细胞总数的5%,并随细胞传代次数的增加,有所增加但不明显。此类细胞的增殖和克隆能力明显低于纺锤样成纤维样细胞。

2.2 MSCs的体外诱导分化 各代细胞经 5μ mol/L、10 μ mol/L、1 5μ mol/L5-Azα诱导液分别诱导24h,细胞均有死亡,且随药物浓度的升高细胞死亡率升高,但细胞代数对细胞的死亡率影响不明显。细胞诱导24 h,贴壁的部分细胞变扁平或呈短棒状。3 d后存活细胞开始增殖,细胞呈细长梭形,少数细胞呈三角形或多边形。培养4周后,80%～90%细胞呈肌纤维状,少数细胞为三角、多边形或铺路石状,细胞出现聚集状生长。不同代数细胞经不同浓度5-氮胞苷诱导四周后均未见自发性搏动。

2.3 细胞生长状况及增殖率测定 MSCs传代培养潜伏期约1 d～2 d,第3天进入对数增殖期,第6天～第7天进入平台期。不同浓度5-氮胞苷诱导的各代MSCs,通过MT T检测,显示诱导后的第2代MSCs增殖能力优于第6代和第10代细胞,第6代与第10代MSCs增殖能力无统计学意义。未经5-氮胞苷诱导的对照组显示,第2代与第6代细胞增殖能力无统计学意义,均优于第10代细胞。药物对细胞增殖能力有一定影响,但随细胞代数的增加其影响有减弱的趋势;药物浓度对细胞增殖能力的影响无统计学意义。详见表1。

表1 相同浓度5-Aza诱导后第2代、第6代、第10代MSCs及对照组第5天增值率(±s)

表1 相同浓度5-Aza诱导后第2代、第6代、第10代MSCs及对照组第5天增值率(±s)

细胞代数 对照组 5 μ mol/L 10 μ mol/L 15 μ mol/L第2代 0.44±0.23 0.53±0.28 0.77±0.283)4) 0.89±0.283)4)第6代 0.42±0.25 0.03±0.201) 0.06±0.131)3) 0.04±0.201)3)第10代 0.26±0.191)2) 0.15±0.241) 0.19±0.201) 0.13±0.181)与第2代比较,1)P＜0.05;与第6代比较,2)P＜0.05;与对照组比较,3)P＜0.05;与5 μ mol/L比较,4)P＜0.05

2.4 心肌特异性肌钙蛋白cTnT的检测 以三种不同浓度5-Aza体外诱导四周的第2代、第6代、第10代BM-MSCs进行细胞免疫化学检测 cTnT、α-Actin表达,各诱导组均表达阳性。说明经三种浓度5-Aza诱导后的第2代、第6代、第10代BM-MSCs已向心肌定向诱导转化,并表达心肌特异性蛋白。

3 讨 论

骨髓间充质干细胞是一种比较原始的骨髓基质细胞,因其具有自我更新、扩增和多向分化潜能,在适宜条件下可被诱导分化为多种组织细胞[6],能够分泌多种细胞因子,支持组织再生和修复,获取途径便利,易体外培养扩增,回植无免疫排斥反应,对组织损伤小等优点[1,4],使得科学家们开始广泛关注MSCs在组织修复和基因治疗中的临床应用。因其具有心肌和血管修复潜能的优点[2],已成为心肌组织工程研究中种子细胞来源的热点之一。但MSCs在骨髓中的含量很低,细胞培养接近高密度时,细胞进入平台期,由纺锤体样形态转变为较大较平的表型[7],细胞的增殖与分化能力可能受到影响。在治疗心肌损伤的疾病时,无论是采用经外周静脉、冠脉、心内膜及心外膜注射等途径,还是进行心肌组织工程构建,首先需要有足够的细胞数量和良好的细胞分化能力,因此如何获得充足细胞数量,同时保持细胞良好的增殖分化能力,成为合理应用MSCs的前提。

能否实现MSCs在体外既保持良好的增殖分化能力又保持多潜能分化能力?李克等[8]将携带人端粒酶逆转录酶(hTERT)目的基因的质粒通过脂质体转染法转入人骨髓MSCs中,显示外源性hTERT基因可以在人骨髓 MSCs中获得异位表达,并能诱导人骨髓MSCs的端粒酶活性,使人骨髓间质干细胞的寿命明显延长而且不影响其维持干细胞的多向分化潜能特性。徐燕等[9]通过携带人端粒酶逆转录酶目的基因的反转录病毒质粒转染人骨髓MSCs,达到了相似的效果。张海红等[10]通过促红细胞生成素与 MSCs共培养,发现MSCs的增殖指数明显增加,促红细胞生成素呈时间、剂量依赖性促进MSCs增殖。亦有通过碱性成纤维细胞生长因子,中药提取物等促进MSCs增殖的报道。实验发现细胞传代次数对细胞数量、增殖能力、分化能力和纯度均有影响。相同药物浓度诱导后的第2代细胞增殖能力优第6代、第10代细胞,第6代、第 10代细胞增殖率无统计学意义。不同药物浓度诱导的同代细胞间增殖能力无统计学意义。随着细胞代数的增加,药物浓度对细胞的增殖能力影响越来越小。经5-氮胞苷诱导的BMSCs表达心肌特异蛋白cTnT、α-Actin,未经诱导的BMSCs不表达心肌特异蛋白。钱海燕等[11]研究表明,第 10代MSCs经5-氮胞苷诱导后心肌特异性蛋白的表达率明显高于第1代、第4代、第8代细胞。由此推之,在增殖能力相同的情况下,细胞代数越高,越有利于细胞数量和诱导分化能力的提高,越有利于细胞移植、组织构建、临床应用中对细胞数量和时间的要求。但细胞增殖能力的强弱与诱导率的高低是否存在一定关系,增殖能力与诱导率何者更有利于修复坏死的心肌还有待进一步研究。

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