超声波辅助碱水提枳实中橙皮苷的研究

陈晓伟，陈荣燕，韦媛媛，廖兰，覃燕玲

（广西工学院生物与化学工程系，广西柳州545006）

超声波辅助碱水提枳实中橙皮苷的研究

陈晓伟，陈荣燕，韦媛媛，廖兰，覃燕玲

（广西工学院生物与化学工程系，广西柳州545006）

采用单因素和正交试验设计探讨超声辅助提取枳实中橙皮苷的最佳工艺。枳实样品碱化后用乙醇超声辅助提取，用分光光度法测定橙皮苷含量。最优提取条件为：4倍量65%乙醇-NaOH溶液（pH为13），50℃超声提取3次每次50 min，加HCl调节pH至7，静置析晶10 h，3批枳实样品橙皮苷平均含量为32.3 mg/g。超声辅助碱水提取枳实中橙皮苷的方法简便可行。

枳实；橙皮苷；超声波辅助提取；正交试验；含量测定

Abstract:To study on the ultrasonic-associated alkali extraction of hesperidin from Citrus aurantium by singlefactor and orthogonal test.Hesperidin was extracted with ethanol-NaOH and determined by UV-visiblespectrophotometry.The optimal ultrasound-associated extraction conditions were 4 times the mass of 65%ethanol-NaOH (pH=13)at 50℃for 50 minitus and extracting 3 times,the extract was precipitated for 10 hours at pH=7.The content of hesperidin was 32.3 mg/g.The optimal extraction technology was stable and feasible.

Key words：citrus aurantium;hesperidin;ultrasonic-associated extraction;orthogonal test;content determination

枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果。枳实具有破气消积，化痰散痞等功效[1]可入药使用，早在中药典籍《神农本草经》中就有记载。枳实中主要含有黄酮、生物碱及挥发油等成分。橙皮苷属双氢黄酮糖苷类化合物，具有抗氧化、抑菌、消炎等作用[2]，可作为药品和食品保鲜剂应用。传统工艺大多采用Ca(OH)2碱提酸沉法直接提取枳实中橙皮苷，近年来有文献报道[3]以有机溶剂辅助碱提酸析提取橙皮苷，提高了提取率，而超声波具有强大的“空化效应”能加速橙皮苷的大量浸出[4]，因而本研究结合超声波法和有机溶剂辅助碱水提取枳实中橙皮苷，通过实验寻找出最佳条件。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

220V 50HZ超声波清洗仪：必能信超声有限公司；ZX-98型旋转蒸发器：巩义市英峪予华仪器厂；UV2100型紫外可见分光光度计：尤尼科仪器有限公司。

1.2 材料与试剂

枳实药材：购于柳州老百姓大药房；橙皮苷对照品：科翔生物科技有限公司；乙醇、甲醇、NaOH、HCl等均为市售分析纯。

2 方法与结果

2.1 工艺流程

枳实粉末50 g→加入pH=13的乙醇-NaOH溶液200 mL→超声波提取→减压抽滤→滤液用HCl调节pH值→静置结晶→减压抽虑→洗涤提取物至洗涤液无色→70℃恒温烘干→称重→得到提取物

2.2 样品中橙皮苷含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取橙皮苷对照品4.0 mg置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，即得浓度为0.080 mg/mL橙皮苷对照品贮备液。

2.2.2 样品溶液的制备

准确称取干燥提取物1.0mg，用甲醇定容至10mL，即为样品溶液。

2.2.3 检测波长的选择

分别取橙皮苷对照品液、样品液适量、溶剂甲醇、乙醇，以空白溶液作参比，用紫外扫描仪，于200 nm～400 nm范围，扫描其最大吸收峰。结果表明，对照品和样品溶液在284 nm处有最大吸收，同时溶剂在此波长下无干扰，故选择284 nm作为检测波长。

2.2.4 标准曲线制备

精密量取橙皮苷对照品溶液 0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL于10 mL的容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，以第1管作空白对照，在284 nm处测吸光度。以橙皮苷对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，橙皮苷在0.008 mg/mL～0.080 mg/mL范围内浓度与吸光度呈良好线性关系，得到回归曲线方程为：Y=18.055X+0.0129，r=0.9990（n=6）。

2.3 枳实提取单因素试验

2.3.1 料液比对提取橙皮苷的影响

称取枳实 50.0 g，加入料液比分别为 1∶2、1∶3、1∶4、1∶6（mL/g）的 pH=13、65%乙醇-NaOH 溶液，加热至 30℃，超声30 min，减压抽滤除去滤渣，滤液用HCl调节pH=7，静置5 h，减压抽滤，洗涤沉淀，烘干，按2.2.2法制备样品溶液，并测定橙皮苷含量。结果见图1，料液比为1∶4（mL/g）时，橙皮苷的提取率达到高峰。

图1 提取液用量对橙皮苷含量的影响Fig.1 Effects of different amounts of extract fluid on the content of hesperidin

2.3.2 超声时间对提取橙皮苷的影响

称取枳实 50.0 g，加入料液比为 1∶4（mL/g）的pH=13、65%乙醇-NaOH溶液，提取时控制温度为30℃，超声提取 10、20、30、40、50、60 min，减压抽滤除去滤渣，滤液用HCl调节pH=7，静置5 h，减压抽滤，洗涤沉淀，烘干，并测定橙皮苷含量。结果见图2。

图2 超声时间对橙皮苷含量的影响Fig.2 Effects of the extraction time on the content of hesperidin

在50 min以后橙皮甙含量有明显的下降趋势。其原因可能是长时间的超声波空化作用对于橙皮甙结构有一定的破坏，使橙皮甙的产量有所下降。故应选择在30 min～50 min内最好。

2.3.3 超声温度对提取橙皮苷的影响

称取枳实50.0 g，加入料液比为1∶4的pH=13、65%乙醇-NaOH溶液，分别控制温度30、40、50、60℃下进行提取30 min，减压抽滤除去滤渣，滤液用HCl调节pH=7，静置5 h，减压抽滤，洗涤沉淀，烘干，并测定橙皮苷含量。结果见图3，随着温度升高橙皮甙含量会逐渐增加，50℃时溶液浸提效果最好，温度继续升高时，浸提效率将降低。且实验过程中出现温度高于60℃后成品颜色发黑，溶出的非橙皮甙成分增加。

图3 温度对橙皮苷含量的影响Fig.3 Effect of the extraction temperature on the content of hesperidin

2.3.4 超声次数对提取橙皮苷的影响

称取枳实50.0 g，加入料液比为1∶4的pH=13、65%乙醇-NaOH 溶液，温度 30℃提取 1、2、3、4次，每次30 min，减压抽滤除去滤渣，滤液用HCl调节pH=7,静置5 h，减压抽滤，洗涤沉淀，烘干，并测定橙皮苷含量，结果表明，表明超声次数从1～3次橙皮甙含量越来越高，但提取到第4次时橙皮甙含量略有下降，因此超声次数选择在3次以内，可以节省时间和资源又可以提高产率，见图4。

图4 提取次数对橙皮苷含量的影响Fig.4 Effects of the numbers of extraction on the content of hesperidin

2.3.5 酸沉pH值的选择

称取枳实50.0 g，加入料液比为1∶4的pH=13、65%乙醇-NaOH溶液，温度50℃提取3次，每次30 min，减压抽滤除去滤渣，滤液用HCl分别调节pH=5、6、7，静置5 h，减压抽滤，洗涤沉淀，烘干，并测定橙皮苷含量。结果表明pH=7时提取物中橙皮苷含量最高。

2.3.6 静置时间的选择

称取枳实50.0 g，加入料液比为1∶4的pH=13、65%乙醇-NaOH溶液，温度50℃提取3次，每次30 min，减压抽滤除去滤渣，滤液用HCl分别调节pH=7，分别静置 4、6、8、12、16 h，减压抽滤，洗涤沉淀，烘干，并测定橙皮苷含量。静置时间越长橙皮甙含量越高，但静置10 h后提取率几乎趋于平衡。

2.4 正交试验

由于超声波辅助碱水提取过程对提取率的影响较大，因此在单因素预试验基础上，选择超声时间（A）、料液比（B）、超声次数（C）、超声温度（D）4个因素进行正交试验考察，按照L9（34）正交表安排试验见表1，结果见表2。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

由极差分析结果得，各因素对橙皮苷提取量的影响顺序为：D（超声温度）＞C（超声次数）＞A（超声时间）＞B（料液比）。最优组合方案为D2C3A3B1，即温度为50℃，超声3次每次50 min，料液比为1∶4橙皮苷提取率最高。

2.5 最优方案验证

按照2.4优化条件提取：称取3份枳实粉末各约50g，加入65%乙醇-NaOHpH值为13的溶液200mL，置于超声波提取器中控制温度为50℃，超声3次，每次50 min，减压抽滤，滤液用HCl溶液调节pH=7，静置10 h，减压抽虑，用去离子水洗涤产品至洗涤液无色。将提取物70℃恒温烘干，称重，准确称取提取物1.0mg，用甲醇定容成10 mL，制备为样品溶液，用紫外-可见分光光度计在284 nm处测其吸光度，并计算枳实中橙皮苷含量，结果见表3。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test

表3 样品测定结果Table 3 Determination results of samples

从表3可看出，最佳提取工艺条件具有较好重复性，橙皮苷得率较高，说明该工艺条件合理可靠。

3 结论

碱提酸沉的原理是利用橙皮甙在碱性条件下开环溶解进行提取，酸性条件下闭环沉淀进行分离。传统工艺中常用生石灰，由于生石灰在水中的黏性较大，对药材有一定包裹作用，不利于橙皮苷的提取，而采用NaOH没有上述缺点[5]，本试验中采用毒性较小的乙醇碱液提取，可提高橙皮苷提取率，文献表明[3]提取液以pH=13为最佳，提取液澄清易过滤。

本文采用超声波辅助碱水提取枳实中橙皮苷，通过单因素考察了超声波碱水提取和酸沉工艺，并用正交试验优化了超声波碱水提取工艺参数，结合橙皮苷含量测定，确定最适工艺条件为：采用4倍量65%乙醇-NaOH溶液（pH为13）50℃超声3次每次50 min，加HCl调节pH=7，静置析晶10 h，将提取产物用分光光度法进行橙皮苷含量测定，3批枳实样品橙皮苷平均含量为32.3 mg/g。结果表明提取产率较高，方法简便可行。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：I部 [M].北京：化学工业出版社,2005：172

[2]张冬松,高慧媛,吴立军.橙皮苷的药理活性研究进展 [J].中国现代中药,2006,8(7)：25-27

[3]杨志学,王余兵,刘彦,等.正交设计优选枳实中橙皮甙提取分离工艺研究[J].怀化医专学报,2003,2(1)：45-48

[4]郝云彬,叶兴乾,徐黎,等.超声技术在橘皮中提取橙皮苷的应用[J].食品与发酵工业,2005,31(11)：63-66

[5]信维平,孙建华,祁宏.陈皮中陈皮甙的提取和应用的研究[J].食品研究与开发,2008,27(2)：154-156

Study on the Ultrasonic-Associated Alkali Extraction of Hesperidin from Citrus Aurantium

CHEN Xiao-wei,CHEN Rong-yan,WEI Yuan-yuan,LIAO Lan,QIN Yan-ling
（Department of Biological and Chemical Engineering,Guangxi University of Technology,Liuzhou 545006,Guangxi,China）

2009-09-29

广西工学院2009年大学生科研立项项目(No.2009030)；广西教育厅科研项目(200911LX185)

陈晓伟（1976—），男（汉），讲师，硕士研究生，研究方向：天然产物的研究与开发。